恒河猴与食蟹猴血清多重细胞因子检测及分析

黄树武，王 静，陈梅玲，罗银珠，潘金春，吴瑞可，何丽芳，闵凡贵

(广东省实验动物监测所，广东省实验动物重点实验室，广州 510663)

非人灵长类(non-human primates)实验动物是生物医学研究中不可替代的重要资源，被广泛应用于人类疾病的模型研究、疫苗与药物的临床前评价[1-3]，是研究HIV感染、免疫和病理的首选动物模型[4-7]。随着非人灵长类实验动物饲养繁育规范化程度提高及动物福利的不断加强，非人灵长类实验动物的标准化程度也越来越高。

在生物医学研究工作中，使用量最多的非人灵长类实验动物是旧大陆猴，其中以恒河猴和食蟹猴为主。早期研究报告分别对恒河猴和食蟹猴之间关于血液生理和生化指标[8-9]、红细胞免疫黏附功能[10]、血液蛋白遗传多样性[11]、生产繁殖性能[12-13]等生物学特性进行测定和分析，获得了重要的基础数据，证实恒河猴与食蟹猴虽然存在某些参数的差异，但总体种属差异性不大。然而，目前国内尚无关于正常食蟹猴与恒河猴细胞因子比较的报道，国外也鲜有报道。本研究将采用高通量xMap技术测定恒河猴与食蟹猴血清多重细胞因子的浓度，并分析恒河猴与食蟹猴间差异，为生物医学研究提供基础数据。

表1 选择的因子信息Table 1 Information of the selected cytokines

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通级恒河猴15只，年龄3.0～4.0岁，其中雄性7只，体重5.0～6.0 kg，雌性8只，体重4.3～5.5 kg，由从化华珍实验动物养殖场提供[SCXK (粤) 2015-0028]，结核菌素试验阴性，排除猴B病毒、猴免疫缺陷病毒、猴逆转录D型病毒和猴T淋巴细胞趋向性病毒I 型。该机构获得了国际AAALAC完全认证，其动物饲养和实验操作在从化华珍实验动物养殖场实验设施[SYXK (粤) 2015-0151]，符合动物福利和伦理要求，并按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

普通级食蟹猴15只，年龄3.0～4.0岁，其中雄性7只，体重3.5～4.5 kg，雌性8只，体重2.5～3.5 kg，由广东春盛生物科技有限公司提供[SCXK (粤) 2014-0027]，结核菌素试验阴性，排除猴B病毒、猴免疫缺陷病毒、猴逆转录D型病毒和猴T淋巴细胞趋向性病毒I 型。该机构获得了国际AAALAC完全认证，其动物饲养和实验操作在广东春盛生物科技有限公司实验设施[SYXK (粤) 2015-0152]，符合动物福利和伦理要求，并按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

液相芯片，由R&D Systems生产，包括2个反应体系，体系1同时测定37种细胞因子(Lot Number: L122018)，体系2同时测定6种细胞因子(Lot Number: L122016)，具体信息见表1。流式细胞仪(BD/FACSCanto 2，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 血清采集

采用非抗凝真空采血管自后肢小隐静脉或前肢皮下头静脉采集血液1～2 mL，4℃冰箱过夜，3000 r/min离心15 min，取上清液，-80℃条件保存。

1.3.2 细胞因子检测

利用流式细胞仪(BD/FACSCanto 2，美国)，采用xMap技术测定血清中43种细胞因子的浓度。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 细胞因子检测分析

所测29种细胞因子按其在感染免疫中的作用，可分为促炎症因子、抑炎症因子、多能细胞因子和其他功能细胞因子，测定结果见表2。其中，19种细胞因子测定结果呈正态分布，F检验结果显示有2种细胞因子方差不齐；10种细胞因子测定结果呈偏态分布。

恒河猴与食蟹猴比较，11种促炎症因子中，仅IL-15存在显著性差异(P﹤0.05)；12种抑炎症因子中，3种细胞因子(IL-1RA、IL-6R α和sCD27)存在显著性群体间差异(P﹤0.05)；其他细胞因子无群体间差异(P﹥0.05)。

2.2 趋化因子检测分析

14种趋化因子的测定结果见表3，其中，11种趋化因子呈正态分布，1种趋化因子F检验结果显示方差不齐；3种趋化因子呈偏态分布。

恒河猴与食蟹猴比较，仅CCL5/RNATES存在群体间差异(P﹤0.05)。

3 讨论

细胞因子具有极强的生物学活性，在生物医学研究中具有重要的意义[14-16]，一方面，可作为药物用于临床许多疾病的治疗，另一方面，细胞因子在体内具有重要的病理作用。在感染、炎症、自身免疫病、免疫缺陷疾病等状态下，部分细胞因子明显变化，通过检测血清、血浆或组织液中细胞因子含量，可以对疾病诊断和治疗做出相应评价，具有重要的临床应用价值。而基础血清、血浆和组织液中细胞因子的水平成为衡量病理状态下细胞因子变化的重要的参考值，是首当其冲要解决的问题。

尽管实验猴的使用数量越来越多，应用范围越来越广，但是其基础生物学特性数据的研究却相对滞后，作为实验猴生产和出口大国，目前，我国尚无关于恒河猴与食蟹猴基础细胞因子水平的研究。本研究采用高通量luminex xMap技术测定了恒河猴与食蟹猴43种血清细胞因子的水平，并进行了群体间比较。结果显示，恒河猴与食蟹猴间仅5种细胞因子存在显著性群体间差异，表明两种猴群体间差异不大。本研究选择的43种细胞因子与感染免疫、肿瘤免疫及自身免疫性疾病相关，提示恒河猴与食蟹猴具有相似的免疫基础，基于两种实验猴开展免疫研究具备较高的可比性。

表2 细胞因子浓度测定结果及比较分析Table 2 Concentrations of detected cytokines and analysis of inter-group differences

备注： *采用Mann-Whitney test，△采用矫正t检验，其他参数采用随机t检验.
Note. *Mann-WhitneyU-test.△Adjustedt-test. Other parameters used the randomt-test.

表3 趋化因子浓度测定结果及比较分析Table 3 Concentrations of detected chemokines and analysis of inter-group differences

备注：*采用Mann-Whitney test，△采用矫正t检验，其他参数采用随机t检验.
Note. *Mann-WhitneyU-test.△Adjustedt-test. Other parameters used the randomt-test.

综上，本研究探讨了恒河猴与食蟹猴血清多重细胞因子水平，证实两种猴基础细胞因子水平差异小，可为生物医学研究提供基础数据，弥补现有资料的不足。