土茯苓中黄杞苷的提取工艺优化及其含量测定*

栾海云 李淑翠 朱海波 兰天驰 刘 慧 张树平

1 滨州医学院药学院药理学教研室 烟台 264003； 2 滨州医学院公共卫生与管理学院预防医学教研室

土茯苓为百合科植物光叶菝葜SmilaxglabraRoxb.的干燥根茎。土茯苓有解毒，除湿，通利关节之功效，用于梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛，湿热淋浊，带下，痈肿，瘰疬，疥癣[1-2]。土茯苓含多种化学成分，如糖类、有机酸类、苯丙素类、黄酮及黄酮苷类、甾醇类、皂苷类及挥发油等，其中黄酮及黄酮苷类被认为是最为重要的药理活性物质，包括黄杞苷、落新妇苷、土茯苓苷、槲皮素、表儿茶精等，黄杞苷在土茯苓中比其他黄酮及黄酮苷类化合物含量相对较高[3-5]。近年研究表明二氢黄酮苷类成分具有抗炎、镇痛等作用[6-8]，黄杞苷具有抗脂质过氧化作用。因此，本实验主要针对土茯苓药材中黄杞苷的提取工艺进行优化，为以黄杞苷作为主要成分的中药新药研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 无水乙醇、甲醇均为分析纯；乙腈、磷酸均为色谱纯；纯净水为娃哈哈纯净水。土茯苓药材编号及产地见表1。黄杞苷对照品(成都普思生物，批号：PS000468)。

表1 土茯苓样品信息

1.2 仪器与设备 高效液相色谱仪(Waters，2695)；色谱柱Ultimate©XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；数控KQ-600DE 型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的黄杞苷对照品适量，加色谱甲醇配成每1 mL含20 μg的黄杞苷对照品溶液。

1.3.2 样品处理 药材粉碎过40目筛，取0.5 g粉末，置于三角瓶中，加入50 mL甲醇，称定，超声45 min。放冷后，称定重量，用甲醇补齐减失的重量，摇匀，过滤，以续滤液为供试溶液，进样10 μL。

1.3.3 色谱条件 色谱柱：Ultimate©XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相: (A∶乙腈，B∶0.1%磷酸)梯度洗脱，洗脱条件见表2；流速为1. 0 mL/min；进样量10 μL，柱温为35℃；检测波长为290 nm。

1.3.4 不同产地土茯苓中黄杞苷含量的测定 本试验采集了中国湖南、广西、云南、贵州4个地区以及越南的土茯苓，按2.2处理样品，按1.3.3 色谱条件，采用外标一点法进行黄杞苷的含量测定。

1.3.5 黄杞苷的提取工艺 精密称取土茯苓粉末2.0 g，分别用95%、80%和70%的乙醇提取，采用回流提取、常温超声波辅助提取和常温渗漉提取三种方法来提取，提取液减压浓缩，甲醇溶解，0.45 μm过滤，取续滤液，按1.3.3色谱条件进行黄杞苷的含量测定。

1.3.5.1 常温超声波辅助提取黄杞苷 精密称取土茯苓粉末2.0 g，维持30 ℃，液料比(1∶25)，分别加入70 %、80 %、95%的乙醇，室温超声提取1 h，补足失重，摇匀，0.22 μm有机膜过滤，取续滤液，进样量10 μL，按1.3.3色谱条件进行黄杞苷的含量测定。

1.3.5.2 回流方法提取黄杞苷 精密称取土茯苓粉末2.0 g，液料比(1∶5)，分别加入70 %、80 %、95%的乙醇，回流1 h，放冷，补足失重，摇匀，0.22 μm有机膜过滤。取续滤液，进样量10 μL，按1.3.3色谱条件进行黄杞苷的含量测定。

1.3.5.3 常温渗漉法提取黄杞苷 精密称取土茯苓粉末2.0 g，加入50 mL不同体积分数的乙醇(70%、80 %、95%)浸泡过夜，渗漉450 mL，乙醇定容至50 mL，摇匀，0.22 μm有机膜过滤。取续滤液，进样量10 μL，按1.3.3色谱条件进行黄杞苷的含量测定。

2 结果

2.1 提取液中黄杞苷HPLC分析色谱方法，见表2。

表2 提取液中黄杞苷HPLC分析色谱方法

2.2 按1.3.3色谱条件下，对照品及不同产地样品的HPLC色谱图见图1，黄杞苷含量见表3。通过比较不同产地土茯苓中黄杞苷的含量，确认越南产土茯苓中黄杞苷的含量最高为0.0575%。

图1 不同产地土茯苓中黄杞苷的HPLC色谱图

表3 不同产地土茯苓中黄杞苷的含量

2.3 按1.3.3色谱条件进行黄杞苷的含量测定，回流提取法、常温超声波辅助提取法和常温渗漉提取法三种提取方法均显示。70%乙醇作为提取溶剂，黄杞苷的含量最高，分别是0.0602%、0.0684%和0.0379%，常温超声波辅助提取法最好，见表4。

表4 不同提取方法土茯苓中黄杞苷的含量

3 讨论

本研究通过HPLC法测定不同产地土茯苓中黄杞苷含量，结果发现越南产地的含量最高为0.0575%。以越南产地的土茯苓为原料，研究了不同溶剂、不同提取方法对土茯苓中黄杞苷提取效率的影响。结果显示，70%乙醇提取率最高，其次是80%乙醇，95%乙醇对其提取率最低，说明黄杞苷的极性比较大，70%浓度的乙醇对黄杞苷具有更好的溶解效果，显示更高的提取效率。本试验还同时研究了回流提取、常温超声波辅助提取和常温渗漉提取法对土茯苓中黄杞苷含量的影响，结果发现常温超声波辅助提取最高，其次是回流提取法，常温渗漉提取法含量最低，说明在超声波辅助下，溶剂穿透能力更强，从药材中溶出目标成分效率更高。本试验考查了提取溶剂和提取方法对土茯苓中黄杞苷提取效率的影响，确定了黄杞苷合适的提取溶剂和提取方法，为后续的纯化奠定了基础。