急性腹泻患儿艰难梭菌感染检测与临床分析

范超萌，林书祥，李璇，王维，方玉莲，彭林

(1天津医科大学，天津 300070；2天津市儿童医院；3天津市儿科研究所)

艰难梭菌(CD)又称难辨梭状芽孢杆菌，是一种专性厌氧、革兰阳性的条件致病菌,是医院获得性腹泻的常见致病菌[1]。最早从新生儿的粪便中分离得到。根据其是否产生致病性，可将其分为产毒菌株和非产毒菌株，其中产毒菌株可产生A/B毒素，引起CD相关性腹泻；非产毒菌株可在宿主体内定植，但并不具致病性。当患者长期大量使用抗生素，造成肠道菌群失调后，CD便会大量增殖，产生大量毒素，引起一系列的肠道症状。临床表现可从轻度的自限性腹泻到严重伪膜性肠炎、脓毒综合征和中毒性巨结肠，甚至于出现肠穿孔等严重后果。既往研究认为， CD感染主要发生于年老体弱或长期使用抗生素的住院患者，儿童并不是CD的易感人群。但最近数据表明，儿童及无抗生素应用史者CD感染的病例数逐渐增多[2]。各地区对CD的检测分析认为，CD感染多见于病程慢性迁延性腹泻患儿，而病毒性腹泻则主要表现为急性起病，且通常1～2 d可以缓解,但近年临床上不断出现急性起病的腹泻患儿经常规抗病毒治疗仍反复发作的情况。2017年8月～2018年7月，我们对1 590份急性腹泻患儿的粪便标本进行了CD感染检测，同时观察其与肠道致泻病毒的合并感染情况，并对检测阳性患儿的临床特征进行分析。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2017年8月～2018年7月就诊于天津市儿童医院疑似病毒感染的急性腹泻患儿粪便标本1 590例份，其中男941例份、女649例份(粪便性状为稀便、水样便、黏液脓血便，每日次数不限)。纳入标准：①符合腹泻诊断标准；②年龄1～192个月，根据CD感染的有关文献，将其分为<3个月、3个月～1岁、1～4岁、4～12岁、12～18岁；③初次发病<2周或经抗病毒治疗后反复发作者；④无其他相关病史、药物使用史的限制。排除标准：①明确为其他原因造成的腹泻；②资料不完整者；③依从性差，不能配合标本留取者。本研究获得天津市儿童医院伦理委员会批准，患儿家属均签署知情同意书。

1.2 细菌基因组DNA的提取 粪便标本(-80 ℃保存)经室温解冻后，用TIANGEN DNA/RNA共提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)进行核酸DNA的提取，并将提取的粪便基因组DNA于-20 ℃保存。

1.3 CD毒素A/B(Tcd-A/B)基因检测 将预存的基因组DNA于室温下溶解，用PCR法检测其毒素基因。Tcd-A/B分别由基因Tcd-A、Tcd-B编码，Tcd-A所用引物为NK1(正向引物)5′-GGACATGGTAAAGATGAATTC-3′, NK2(反向引物) 5′-CCCAATAGAAGATTCAATATTAAGCTT-3′，目的片段为546 bp；Tcd-B所用引物为NK104(正向引物)5′-GTGTAGCAATGAAAGTCCAAGTTTACGC-3′，NK105(反向引物)5′-CACTTAGCTCTTTGATTGCTGCACCT-3′，目的片段为204 bp。每次反应均设立空白对照，在GeneBank中对引物序列进行BLAST比对，结果证明所得产物确实为Tcd-A/B的编码基因,反应体系共25 μL，反应程序：94 ℃预变性10 min，然后94 ℃变性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。所得产物取5 μL点样于1.5%的琼脂糖凝胶，95 V电泳20～30 min，将胶块置于凝胶成像系统下曝光，观察有无特异性扩增的条带。

1.4 其他病毒的检测 用金标法检测所有标本轮状病毒、嗜热弯曲菌(轮状病毒、嗜热弯曲菌检测试剂盒，艾博生物医药杭州有限公司)的感染情况，同时用PCR法对所有标本进行腺病毒、诺如病毒(NoV)、博卡病毒检测。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料用频数、百分比表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病原学检测结果 1 590例份急性腹泻患儿标本有79例份Tcd检测阳性，阳性率为4.97%；NoV阳性410例份，阳性率25.79%；二者合并感染21例份，混合感染率26.58%(21/79)。在Tcd阳性的患儿中，仅Tcd-B阳性(A-B+)63例(A-B+组)，阳性率为3.96%，Tcd-A、Tcd-B均阳性(A+B+)16例(A+B+组)，阳性率为1.01%，未检测到仅Tcd-A(A+B-)阳性患儿。

2.2 CD感染患儿的年龄和性别分析 在79例份Tcd检测阳性标本中，患儿男43例(4.57%)、女36例(5.55%)，性别比较差异无统计学意义(χ2=0.09,P=0.76)；年龄最大者136个月，最小者1个月，中位年龄12个月，平均年龄23.24个月，≤3个月者8例(4.91%)，3个月～1岁者43例(4.90%)，1～4岁者19例(4.94%)，4～12岁者9例(5.66%)，不同年龄段间Tcd的阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.14，P=0.99)。

2.3 CD感染的季节分析 春季患儿563例，Tcd阳性44例，Tcd阳性检出率为7.82%；夏季患儿320例，Tcd阳性18例，Tcd阳性检出率为5.63%；秋季患儿135例，Tcd阳性2例，Tcd阳性检出率为1.48%；冬季患儿572例，Tcd阳性15例，Tcd阳性检出率为2.62%。CD阳性检出率在季节分布中差异无统计学意义(χ2=6.44，P=0.09)。

2.4 Tcd阳性患儿的一般临床特征 79例份阳性标本中，病程<2周者67例(84.81%)，病程在2周～2个月者11例(13.92%)，病程>2个月者1例(1.27%)。稀便53例(67.09%)，水样便22例(27.85%)，便中带血4例(5.06%)。大便频次<3次/d者42例(53.16%)，3～5次/d者25例(31.65%)，5～10次/d者5例(6.33%)，>10次/d者7例(8.86%)。患儿除腹泻外，还伴有其他临床症状，其中伴肺炎33例，支气管炎10例，哮喘3例，脓毒症6例，支原体感染2例，泌尿系感染8例，中耳炎5例；脱水8例，代谢性酸中毒13例，低钾血症6例，呕吐38例，发热70例，贫血31例，低蛋白血症10例，CRP升高27例，白细胞增高24例，白细胞减低12例，粒细胞减少29例，白血病7例；使用抗生素65例。

2.5 A+B+组与A-B+组临床特点比较 通过对A+B+组与A-B+组的临床资料进行对比，得知两组之间在性别比、年龄病程、腹泻次数、抗生素使用情况、发热比例、贫血比例、CRP、白细胞等比较差异无统计学意义。其中A+B+组男9例、女7例，平均年龄20.88个月，病程6.63 d，腹泻次数3.31次，使用抗生素者14例(87.5%)，发热患儿16例(100%)，贫血患儿6例(37.5%),白蛋白减低者2例(12.5%)，CRP均值29.28 mg/L，白细胞均值8.26×109/L。A-B+组男34例、女29例，平均年龄20.47个月，病程10.29 d，腹泻次数4.38次，使用抗生素者52例(82.81%)，发热患儿55例(87.5%)，贫血患儿25例(39.06%),白蛋白减低者8例(12.70%)，CRP均值19.80 mg/L，白细胞均值8.95×109/L。

2.6 混合感染 79例份Tcd检测阳性患儿标本中，检测到腺病毒阳性4例(5.06%)，轮状病毒阳性11例(13.93%)，NoV阳性21例(26.58%)，博卡病毒阳性0例。

3 讨论

CD是一种革兰阳性专性厌氧产芽孢菌，在自然环境中广泛存在，是一种条件致病菌。CD以滋养体和芽孢两种存在形式，形成休眠体的芽孢可在艰难环境条件下生存数十年，并能抵抗多种理化因素的干扰。在机体免疫力正常时可在肠道内定植，而不出现腹泻等临床症状。近年来，随着抗生素及免疫制剂在儿科的广泛使用，CD感染在儿科的发病率逐年升高。Kim等[3]对美国22所儿童医院住院患儿的CD发病率进行统计发现,2001～2006年CD的发病率从2.6‰增加到4.0‰，呈稳步增长趋势。而国内最早关于CD的研究报道是2009年Cheng等[4]在香港的研究，其收集的723份粪便标本中，CD阳性37份，阳性率为5.1%。本研究对天津市儿童医院急性腹泻患儿CD的检测，共检出79份阳性标本，阳性率为4.97%，低于2015年苏州大学附属儿童医院的12.5%[5],2010年上海地区的14.41%[6]，2015年武汉地区的22.2%[7]，同时，与邻近的北京地区相比，低于2012年郭姝等[8]的37.6%，2015年赵春娜等[9]的49.6%，而与2014年广州地区的6.8%[10]，2015年深圳地区的5.93%[11]，2015年珠江地区的4.76%[12]较接近，表明在急性腹泻患儿中可出现CD感染，但其阳性率低于慢性腹泻迁延性腹泻患者，其中在NoV阳性的410例患儿中，21例同时合并CD感染，表明NoV与CD可存在合并感染，在79例阳性患儿中，有65(82.28%)例患儿可确定入院前后曾用抗生素，可见患儿Tcd的感染情况与抗生素使用史有关，不同地区Tcd阳性率存在较大差异，这可能与不同地区医疗卫生部门抗生素使用习惯有关。

在79例阳性患儿中，Tcd-A、Tcd-B均阳性(A+B+)者为16例，占阳性患儿的20.25%，Tcd-B阳性而Tcd-A阴性(A-B+)者63例，占阳性患儿的79.75%，此与2015年北京地区[9]的流行情况(Tcd-A、Tcd-B均阳性者占20%，仅Tcd-B阳性者占80%)较为一致，而美国、欧洲、亚洲的研究中，不同地区A-B+菌株的流行率不同，在美国约0.2%，欧洲为2.5%～3.0%，日本为6.7%～39.0%[13]，上海为33.3%，而朝鲜为17.6%～54.8%[14]，表明不同地区Tcd的流行菌株不同，而2012年郭姝等[8]对北京地区的研究中，仅Tcd-B阳性患儿占比为5.7%，不同于2015年北京地区的研究[9],表明同一地区不同时间段Tcd的流行菌株存在差异。

在Tcd检测阳性的79例患儿中，男43例(54.43%)，女36例(45.57%)，不同性别患儿Tcd的阳性率比较差异无统计学意义，表明CD的感染情况与患儿性别无关。对1 590例患儿按年龄段进行分组研究，结果显示，各年龄段间的阳性检出率差异无统计学意义，各年龄段均可发病，本研究中，3个月～1岁患儿占比最高，与选取的标本主要集中在3个月～1岁有关，而4～12岁患儿阳性率略高于其他年龄段，不同于2015年程国平[7]等的研究(CD感染阳性率最高的患儿集中在3个月～1岁)。对1590例患儿按季节分组进行研究，不同季节感染率差异无统计学意义，而对1 590份标本按季节进行研究，各个月份间的阳性率差异无统计学意义，与其他地区研究一致。

在检测阳性的79例患儿中，其中有稀便、水样便的患儿占94.93%，与Sammons等[15]研究结果类似。82.28%的患儿有抗生素使用史，与2017年王小燕等[16]报道一致，高于2015年李英杰等[5]的报道，79例阳性患儿除了腹泻症状外，同时伴有呕吐48.10%、发热88.61%、贫血39.24%、CRP增高34.18%、白蛋白减低12.66%、粒细胞减低36.71%，与赵春娜等[9]研究一致。将79例患儿分为A+B+组与A-B+组进行比较，两组在性别比、年龄、病程、腹泻次数、抗生素使用情况、发热比例、贫血比例、CRP、白细胞等比较差异无统计学意义，与2015年赵春娜等[9]研究一致。

综上所述，本研究中在Tcd检测阳性的菌株以A-B+为主，未检测到A+B-的标本，患儿的阳性率低于北京、苏州的多个地区，可能与本地区良好的抗生素使用习惯有关。因此，合理使用抗生素，做好院内感染防护工作，维护环境卫生，维持肠道微生态平衡对降低CD的感染率至关重要。