浅析血凝抑制试验操作注意事项

崔 旭 黄春华

（1.重庆市石柱县下路街道畜牧兽医站，重庆 409100；2.重庆市石柱县动物疫病预防控制站，重庆 409100）

血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，一种测定抗原或抗体的技术。即加入特异性抗体或特异性抗原后，使原有的血凝反应被抑制，动物疫病方面主要用于H5亚型与H7亚型禽流感、新城疫等疫病的免疫抗体滴度测定，为免疫程序的制定提供技术支撑。为现行的家禽调运监管政策，H7亚型禽流感监测报告出省有效期为21天提供指导依据。此法简称“75μl”法，虽然看似简单，但在阿氏液、PBS液、1%红细胞制备、抗原验证、4倍病毒抗原回归试验等方面仍存在许多注意事项，只有做好操作过程中的每个细节，方能最大限度减少误差，确保结果的准确性。现将试验过程中注意事项简单分析以下：

1 实验前的工作准备注意事项：

（1）房间温度应恒温控制在20～25℃，温度过高或者过低都会影响实验反应时间，所以整个实验过程应控制在一个恒定的温度下完成。

（2）工作台在实验进行前和实验结束后都要彻底消毒，以免造成污染，建议用75%酒精均匀的喷洒工作台反复三遍。

（3）样品与试剂均应提前20min从冰箱取出恢复至常温后，方可进行实验。

2 材料的准备注意事项

（1）96孔微量反应板的选择，在选择反应板的时候一定要仔细观察是V型还是U型，本实验应该选着V型反应板，当不便观察的时候可以用手触摸孔底有尖尖的刺感来判断是V型还是U型。

（2）PBS液、阿氏液和1%红细胞的制备：阿氏液和PBS液配制过程中应注意酸碱度的调整，阿氏液pH值应调整在6.1，PBS液pH值应该在7.2，配置好的阿氏液和PBS 液经高压灭菌后方可使用，或者4℃保存，但保存时间不宜过长，一般不超过21d。1%红细胞配制过程中，在选择公鸡时一定要选择无特定病原（SPF）公鸡3～5只。在洗涤红细胞离心机转速保持在1500转左右约3～5min，转速过快会造成红细胞破裂造成溶血。洗涤次数保持在4～8次之间，实际操作过程中以离心后的上清液与PBS液保持同等清晰度时为准，备用。

3 实验过程中注意事项

（1）病毒抗原效价的测定，每次试验前均应检测病毒抗原效价，因为病毒抗原效价一经使用会随着使用次数逐渐降低，在恒温状态下应充分保证静置反应时间在40min后以最后1孔完全凝集状态读取结果。

（2）倍病毒抗原液的配制及验证，此项是本实验操作的关建，以病毒抗原log2效价除以4作为抗原稀释倍数，例如抗原效价为log10，则稀释倍数为256，验证配制好的4倍抗原液以前2孔完全凝集状态，第3孔为半凝集状态（出现点状红细胞沉集，泪流状态不明显），第4孔红细胞成纽扣状沉于孔底，红细胞完全沉集泪流状态明显下流。若回归试验未成立，则需重新测定抗原效价、配备4倍抗原再次回归试验直至成立，以最佳状态的稀释倍数抗原备用。

（3）样品稀释，将恢复常温的样品加入到凝集板中，加样时枪头应悬空，并一次性排出样品，做明样品和阴阳性对照标记。倍比稀释过程中，避免枪头松动吸入空气，产生气泡，移液器每孔吸放次数在10次左右，稀释至第10孔结束，若操作过程倍比稀释不好，会产生跳孔现象。

（4）结果判定，在红细胞加入后静置40min后方可读取结果，实际操作过程中可以参照对照红细胞孔将呈明显的纽扣状沉于孔底、对照病毒抗原孔出现完全凝集时，可读取结果，读取结果时应将反应板作45°倾斜，背面垫A4纸作为底色，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。读取结果应在10min之内完成，时间过久会导致反应时间过长，误判效价。