嗜水气单胞菌高免血清的制备及效价测定

崔 旭 黄春华

（1.重庆市石柱县下路街道畜牧兽医站，重庆 409100；2.重庆市石柱县动物疫病预防控制站，重庆 409100）

嗜水气单胞菌属于弧菌科，气单胞菌属。气单胞菌属根据有无运动力可分为两类；一类是嗜冷性、非运动性的气单胞菌，另一类为嗜温性、运动性的气单胞菌。嗜水气单胞菌属第二类，在气单胞菌属中是最重要的，它是气单胞菌的模式种。非运动性气单胞菌主要是对鲑鳟鱼等致病的杀鲑气单胞菌及其亚种。嗜水气单胞菌在过去有不同的名称，主要的名称有点状气单胞菌和斑点气单胞菌。嗜水气单胞菌广泛存在于淡水、污水及土壤。有很多资料记载，嗜水气单胞菌对水产动物、家畜和人均有致病性，在动物疾病学和食品卫生学研究上都具有重要意义。它能广泛地被分离到，如在淡海水鱼，淡水虾类，淡水蟹类中和养殖蛙体内，也能引起爬行类疾病。有许多报道证明它也能感染人类发病，最常见的是嗜水气单胞菌引起急性霍乱。同时，它广泛分布于人类的食物链，供水系统和土壤中。

嗜水气单胞菌既是恒温动物与变温动物的条件致病菌，又是原发致病菌。但是，AUSTIN等报道嗜水气单胞菌通常在自然界是条件致病菌，充当继发病原而不是原发病原。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：嗜水气单胞菌XS9141。

1.1.2 培养基：普通肉汤培养基，鲜血平板培养基。

1.1.3 药品：甲醛 1%叠氮钠

1.1.4 试验动物：1.5～2㎏/只。

1.2 方法

1.2.1 菌种复壮：将菌种接种巧克力培养基中，在28℃的条件下培养24h，形成单个菌落。

1.2.2 疫苗的制备：挑取单个菌落到5ml普通肉汤培养基中，28℃振荡培养24h，再倒入100ml普通肉汤培养基，28℃振荡培养24h。涂片镜检、OD值的测定。然后加0.4%的甲醛溶液于37℃条件下灭活24h，每100ml加入1ml 1%叠氮钠防腐，不加佐剂，制成非佐剂疫苗，4℃条件下保存。

1.2.3 免疫：取1.5kg左右的非免疫家兔四只，随机分成两组，每组两只，实验组和对照组。实验组分五次免疫，耳静脉注射，每次间隔7d，第一次注射0.5ml/只；第二次注射0.5ml/只；第三次注射1 ml/只；第四次注射1.5 ml/只；第五次注射2 ml/只；空白对照组不注射，同样条件下饲养。

1.2.4 血清的分离与保存：每次免疫后间隔7d耳静脉采血，五次免疫完后间隔14d采取心脏采血，常温下静置，待血液完全凝固后置4ºC冰箱过夜析出血清，按0.01%的比例加入1%叠氮钠防腐，充分混匀后按3ml每瓶分装到无菌青霉素瓶子，放置-20℃冰柜中保存备

1.2.5 检测抗原的制备：将嗜水气单胞菌，接种于5ml普通肉汤，在28℃的条件下震荡培养24h后，将菌液转入盛装有50ml普通肉汤的三角烧瓶中，在28℃的条件下震荡培养24h，取出。将上述菌液在4000r/min 离心20min，取上清液，装入无菌青霉素瓶子，放置-20℃冰柜中保存备用。

1.2.6 抗体效价的测定：采用凝集试验检测抗体效价。参照Roberson的方法做微量板凝集试验。在96孔u型板上用PBS缓冲液倍比稀释待检血清，使终容量为100μl/孔，并以PBS缓冲液孔作阴性对照；然后加入抗原，50μl/孔，4℃ 过夜，判断结果如图1。

2 试验结果

本试验主要是通过将嗜水气单胞菌接种到巧克力培养基里复壮后制成非佐剂疫苗，采用耳静脉注射，免疫非免疫家兔诱发产生免疫力制备高免血清，采用凝集试验检测抗体效价。第7天凝集效价为1：16，第14天凝集效价为1：64，第21天凝集效价为1：512，第28天凝集效价为1：1024，第35天凝集效价为1：2048，第42天凝集效价为1：2048，结果显示最高凝集效价是1：2048。对照组没有检测到嗜水气单胞菌的抗体。

3 分析讨论

（1）实验结果显示，家兔在第一次免疫后的第7天就能检测到凝集效价，第二次、第三次、第四次的凝集效价都比前一次的要高，在第四次、第五次和第六次检测时结果显示已经保持平衡，不在增加，最高凝集效价也就在第四次检测出为1：2048。而对照组没有检测到凝集效价。

在注射剂量的选择时第一次和第二次都是用0.5ml，以后每次递增0.5ml，因为注射途径是耳静脉注射，直接进入血液，如果第一次的注射剂量过大，会造成实验动物无法适应，从而引起一些不适应症或死亡，要有一个过渡阶段，这样免疫效果才会更佳。

通过结果显示，28d的效价高于21d，21d的效价又高于14d，14d的效价又高于7d，而每次的剂量和时间都在原有的基础上有所增加，应此我们可以推测凝集效价的高低与剂量和时间有关。28d、35d和42d的效价都为1：2048，第五次注射的剂量比第四次的要高时间要长，但效价却没有增加，这可以说明效价达到一定高度的时侯凝集效价就不在增加。

（2）目前，对其他菌的高免血清的研究较多，但是对嗜水气单胞菌高免血清的研究的文献报道还没有，本试验所产生的数据可为嗜水气单胞菌高免血清研究提供参考、依据。

（3）目前，检测抗体的方法有很多，如：琼脂双向扩散试验、免疫荧光试验、血清中和试验等。但凝集试验所需设备简单，操作方便、易行，现象明显，易于观察。于是本次试验采用了凝集试验检测血清抗体效价。

4 结论

从本试验看，嗜水气单胞菌中含有可以使机体产生抗体的物质，而本试验采用的免疫方法可以使这些物质刺激机体产生抗体。