子宫内膜异位症不孕患者的卵母细胞形态及体外受精-胚胎移植结局观察

宁艳春，韩宝生，刘秀荣，李宜学，郭剑，赵铭佳，刘海静

(唐山市妇幼保健院，063000)

子宫内膜异位症近年来发病率逐渐增高，且子宫内膜异位症患者的妊娠结局较差。不孕症患者体外受精-胚胎移植(IVF-ET)过程主要涉及选卵、受精、胚胎培养以及胚胎移入子宫等，其中选卵过程中卵母细胞质量的准确评估是预测后期的正常受精、适时卵裂、最终临床妊娠的关键。卵母细胞质量的评估方法主要涉及形态、细胞学以及分子水平上的研究，其中卵母细胞形态是指评估卵母细胞的胞浆均匀程度是否有颗粒或空泡、卵周隙大小、透明带形态以及薄厚是否正常、极体大小形态等。本研究观察了子宫内膜异位症不孕患者的卵母细胞形态及IVF-ET临床结局。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2010年6月～2018年6月在唐山市妇幼保健院接受辅助生殖技术(ART)助孕的648例子宫内膜异位症不孕患者(共5365个成熟卵母细胞)为观察组，选取同期785例因男性因素致不孕症患者(共7015个成熟卵母细胞)为对照组。观察组患者年龄23～38(28.23±6.98)岁，不孕年限1～10(6.12±6.36)年，BMI(21.56±3.26)kg/m2，窦卵泡数(AFC)(4.52±1.36)个，促卵泡生成素(FSH)(6.26±2.36)IU/L，促黄体生成素(LH)(6.36±2.10)IU/L，雌二醇(E2)(23.5±3.65)pg/mL；对照组患者年龄21～42(27.35±5.69)岁，不孕年限1～11(5.36±5.63)年，BMI(20.91±2.35)kg/m2，AFC(5.36±1.98)个，FSH(5.63±3.26)IU/L，LH(5.69±2.35)IU/L，E2(20.6±4.36)pg/mL；两组患者基础资料相比，P均>0.05。纳入标准：①观察组患者均为首次发现囊肿，经腹腔镜手术或B超下囊肿穿刺证实；②对照组患者均为男方少、弱、畸形精子症导致的不孕；③基础内分泌正常，月经规律；④排除其他ART的禁忌症；⑤两组患者对应的男性精液分析显示都可以进行常规受精。

1.2 两组患者的卵母细胞形态观察 观察组患者采用超长方案进行控制性促排卵：月经第5天时注射第1支长效促性腺素释放激素激动剂(GnRHa)达菲林3.75 mg，各间隔28天后分别注射第2、3支达菲林，最后1只达菲林注射后第35天进行超声及血清激素检查，待达到降调标准后，加用FSH果纳芬和/或尿促性素(HMG)150～375 IU/d进行控制性促排卵治疗。降调标准：内膜厚度<6 mm、双侧卵巢未见卵泡发育、血清E2浓度30～55 pg/mL(109.8～201.3 pmol/L)。对照组患者采用长方案进行控制性促排卵：月经第5天开始口服妈富隆，每日1片，共21 d，服药第19天予达菲林0.1 mg皮下注射，每日1次，待达到降调标准后，加用FSH果纳芬和/或HMG 150～375 IU/d进行控制性促排卵治疗。两组患者进行控制性促排卵治疗后，当有2个卵泡直径>18 mm或3个卵泡直径>17 mm时，肌注人绒毛膜促性腺激素(hCG)5 000～10 000 IU，之后36～38 h取卵。所有卵泡的发育监测都由1位有经验医师完成。当日8：30取卵后培养2～3小时，然后常规授精，之后4～6小时观察并计数成熟卵母细胞数；取卵后第1天7：00～8：00，观察两组成熟卵母细胞形态，计算正常形态、胞浆颗粒粗、卵周隙大、透明带厚、极体碎卵母细胞所占比例。

1.3 两组患者的IVF-ET临床结局观察 ①取卵后第1天7：00～8：00，计数成熟卵母细胞的正常受精卵数，计算正常受精率，正常受精率=正常受精卵数/成熟卵母细胞数×100%。②胚胎移植当天观察并记录受精卵的卵裂数、胚胎总数、优质胚胎数，计算卵裂率和优胚率，卵裂率=卵裂数/正常受精卵数×100%，优胚率=优质胚胎数/胚胎总数×100%。③移植后第14天检测β-hCG，β-hCG>25 IU/L为生化妊娠，计算生化妊娠率，生化妊娠率=生化妊娠数/移植周期数×100%。④移植后第28天进行B超检查，确定是否临床妊娠，计算临床妊娠率，临床妊娠率=临床妊娠数/移植周期数×100%。⑤后期随访流产率，流产率=流产数/临床妊娠数×100%。

2 结果

2.1 两组患者的卵母细胞形态比较 观察组患者正常形态、胞质颗粒粗、卵周隙大、透明带厚、极体碎的卵母细胞占比分别为67.23%±28.3%、6.92%±1.31%、10.41%±3.65%、7.91%±2.68%、7.52%±2.13%，对照组患者正常形态、胞质颗粒粗、卵周隙大、透明带厚、极体碎的卵母细胞占比分别为75.01%±20.35%、5.63%±1.73%、6.32%±2.34%、7.22%±2.35%、5.86%±2.03%，两组患者正常形态、卵周隙大的卵母细胞占比相比，P均<0.05。

2.2 两组患者的IVF-ET临床结局比较 观察组患者的正常受精率、卵裂率、优胚率、生化妊娠率、临床妊娠率、流产率分别为75.38%±20.36%、96.32%±30.43%、10.42%±3.24%、34.95%±7.65%、27.54%±7.65%、1.32%±0.35%，对照组患者的正常受精率、卵裂率、优胚率、生化妊娠率、临床妊娠率、流产率分别为89.67%±25.63%、98.86%±32.54%、26.35%±8.36%、57.23%±13.65%、52.81%±15.96%、0.98±0.29%，两组患者的正常受精率、优胚率、生化妊娠率、临床妊娠率、流产率相比，P均<0.05。

3 讨论

子宫内膜异位症是妇科常见病，发生率较高，一般在10%～15%左右，且有逐年增加的趋势[1]。在人工助孕领域子宫内膜异位症合并的不孕症患者逐渐增多。由于异位内膜影响的卵巢周围环境的改变，盆腔巨噬细胞浓度增高及活化、T淋巴细胞改变、细胞因子和前列腺素的分泌等使卵母细胞发育受损，影响IVF-ET过程中的卵母细胞质量、受精情况、胚胎质量、着床内膜环境等，从而导致其临床结局较差[2～4]。

成熟卵母细胞形态学质量评估是目前简单易行的非侵入性的预测IVF-ET临床结局的方法，其中形态学评估也包括卵冠丘复合物以及纺锤体的情况，其中形态学评估包括卵母细胞的胞质是否有颗粒、透明带薄厚、极体大小形态、卵周隙大小、卵冠丘复合物以及纺锤体的情况等。本研究未进行卵冠丘复合物以及纺锤体的观察，是由于选卵的时候需尽量减少卵子在体外暴露的时间，而且只能是选卵者在选卵的同时进行卵冠丘复合物的大致观察，收集的所有卵冠丘复合物(包括各阶段的不成熟卵、成熟卵，)均集中于一个皿中，不便于分析观察，且本研究只是观察成熟卵母细胞的形态学信息，所以未将卵冠丘复合物的评价列入其中；由于纺锤体对于胞质周围环境的改变非常敏感，很容易在体外操作和减数分裂成熟过程中遭到破坏，限制了纺锤体观察的临床应用和分析，所以本研究也未将纺锤体的观察列入其中。本研究仅选取了培养过程中比较容易观察到的卵母细胞的形态包括卵胞浆中是否有颗粒、透明带是否过厚、卵周隙是否过大、极体是完整还是碎裂这4种异常情况进行观察。

正常受精后的卵母细胞为后期胚胎的正常发育提供绝大部分的营养支持，为胚胎的适时卵裂、分化、着床做好准备，因此卵母细胞质量在IVF-ET过程中是非常关键的因素之一[5]。关于卵母细胞的形态异常有两种对立的观点，一种观点认为卵母细胞形态跟IVF-ET临床结局关系不大[6～8]，另一种观点认为卵母细胞形态跟IVF-ET临床结局有一定的关系。正常的成熟卵母细胞形态主要包括形态大小合适的第一极体、看似均匀正常的胞浆、薄厚合适的透明带以及大小恰当的卵周隙。在IVF-ET助孕促排卵过程中由于大量促卵泡激素的应用，卵母细胞的胞浆与胞核的同步成熟发育是关键[9，10]。形态正常的卵母细胞不一定是胞浆和胞核同步发育，那么形态异常的卵母细胞是不是有可能是胞浆与胞核未同步发育的一种外在表现呢？本研究分析了评价卵母细胞形态质量中较常见的几类卵母细胞，包括颗粒粗、周隙大、透明带厚、极体碎等4种常见异常形态在子宫内膜异位症不孕患者和男性因素致不孕症患者中发生的比例，结果显示子宫内膜异位症不孕患者的卵母细胞正常形态比例较低，形态异常的卵母细胞周隙大的所占的比例较高。

卵周隙是卵细胞膜和透明带之间的空隙，其内含第一极体。在卵母细胞发育的过程中，成熟前卵母细胞的形态就是极体刚刚从卵胞膜中排出来，极体扁平，卵周隙很小。那么卵周隙大的卵母细胞是怎样形成的呢？目前研究[11]发现，卵周隙大的卵母细胞有可能是卵子过熟导致胞浆皱缩，造成了卵周隙变大，另一种说法是排出第一极体时伴随释放了大量的糖蛋白，造成了卵周隙变大。有研究发现，卵周隙的大小与卵母细胞的受精率、后期卵裂率以及发育潜能，着床潜力有一定的联系。本研究结果显示，与对照组相比，观察组患者卵周隙大的形态异常卵母细胞的比例显著升高，而正常受精率、优胚率、生化妊娠率以及临床妊娠率显著下降。那么是否有可能是子宫内膜异位症不孕患者卵周隙大的卵母细胞增多导致卵母细胞总体质量下降，最终导致IVF-ET临床结局较差呢？这有待于我们进一步研究。与对照组相比，观察组的流产率也是显著增高的，我们认为这可能与其特殊的卵巢、盆腔微环境和较差的胚胎质量有关。

综上所述，与男性因素致不孕症患者相比，子宫内膜异位症不孕患者的正常形态卵母细胞占比降低、卵周隙大的卵母细胞占比升高，正常受精率、优胚率、生化妊娠率以及临床妊娠率下降，流产率显著增加，IVF-ET临床结局较差，提示子宫内膜异位症不孕患者卵巢局部微环境的改变有可能影响卵母细胞生长发育的过程，使卵母细胞质量发生改变，进而导致临床指标的改变，有待于深入研究。