神经纤维蛋白-1功能及在乳腺癌发生发展和诊治中的作用研究进展

李鹤，王洁，顾娇娇，王鑫璐

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳110000)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率有不断增长的趋势，对女性的健康产生了巨大的危害。虽然近些年来对乳腺癌已经应用了手术、放化疗、内分泌治疗等多种治疗方式相结合的综合治疗方案，但其临床效果不尽如人意，耐药及复发率高仍是临床治疗中的主要难题，因此急需寻找新的治疗方法，以个性化的方式精确调整治疗方案。近年来，对乳腺癌治疗的广泛研究推动了细胞毒性治疗和生物驱动的靶向治疗的发展，神经纤维蛋白-1(NRP-1)作为一个多功能受体，在很多肿瘤的发生发展中都发挥着一定作用。现就NRP-1的功能及其在乳腺癌的发生发展、诊断和治疗中的作用研究进展综述如下。

1 NRP-1的功能

A5神经元特异性细胞表面抗原最初在爪蟾胚胎中被鉴定出来，随后被重新命名为神经纤维蛋白(NRP)。研究人员同时发现人类基因组中还存在另一种神经纤维蛋白样基因，因此，神经纤维蛋白被改名为NRP-1。NRP-1是一种I型跨膜糖蛋白，在脊椎动物中高度保守，由胞外区、跨膜区及胞内区三部分组成，其中胞外区又有三个不同的结构域，分别称为a1/a2、b1/b2和c结构域。a1/a2结构域参与3类信号素(Sema3A)的结合；b1/b2结构域是NRP-1与其配体结合的位点，介导其与多糖硫酸肝素和血管内皮生长因子165(VEGF165)的结合[1]；近膜的c结构域的功能是介导NRP-1的二聚化，传导NRP-1配体的信号。NRP-1的跨膜区及短的胞内区归入d结构域，不是NRP-1发挥作用所必需的[2]。

1.1 NRP-1调节血管生成 VEGF是调节血管生成最主要的因子，NRP-1作为其共受体参与血管的生成。人类的VEGF单体存在5种不同的亚型：VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206，其中VEGF165是VEGF生物学活性的主要存在形式，在各种细胞表达中占优势。VEGF165在血管生成中起着重要作用，能够诱导血管增生。研究[3]发现，NRP-1在内皮细胞上的表达增强了血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)对VEGF165同种型响应的生物学活性，提示NRP-1是VEGF165的共受体，并且形成了NRP-1参与体内VEGF介导的血管生成的理论，是调节血管生成的关键因素。同时研究人员[1,3,4]还发现，NRP-1在卵黄囊和胚胎中的血管发生、血管生成、女性子宫周期性血管增殖以及血管的损伤修复中都扮演着重要角色，这说明NRP-1在生理和病理性血管生长中都发挥着重要作用。而Plein等[1]则通过小鼠试验进一步证明了NRP-1介导的VEGF信号传导对于围产期和病理性新血管形成比胚胎血管发育更为重要。

1.2 NRP-1调节肿瘤发生发展 血管生成在支撑实体肿瘤生长中起重要作用，而NRP-1基因的表达通过VEGF增强肿瘤血管新生最终导致肿瘤体积增大，同时肿瘤衍生的NRP-1还充当着血管生成的正调节剂。不仅如此，相关研究[5]表明，NRP-1作为VEGF的共受体高表达于肿瘤脉管系统和肿瘤细胞，如乳腺癌细胞系每个细胞上约有2×105个NRP-1,在同一肿瘤细胞上,NRP-1与VEGF165、VEGFR2形成二聚体复合物增强了VEGF的结合能力及功能，而且可以不依赖VEGF独立介导促血管生成作用及抗凋亡作用，这提示NRP-1自身可能具有信号转导功能。近期的研究[4; 6]还表明，NRP-1能通过与Sema3A、转化生长因子β(TGF-β)相互作用从而促进纤连蛋白聚集，改善肿瘤微环境，促进肿瘤的发生发展。研究[7]发现，肿瘤来源的VEGF为癌症干细胞(CSCs)创造血管周围生态位，并通过NRP-1在自分泌环中直接影响CSCs，以调节皮肤肿瘤的起始和细胞干性。多效磷(PTN)是一种多效生长因子，具有血管生成特性，参与肿瘤的生长和转移。Rania等[8]通过抗体沉默或阻断NRP-1可抑制PTN诱导的人脐静脉内皮细胞迁移和肿瘤细胞侵袭，形成了NRP-1是一种新的PTN受体、NRP-1介导PTN诱导的细胞迁移和侵袭的论点，这为NRP-1促进肿瘤进展提供了新的证据。研究[9; 10]证实，肿瘤自分泌的VEGF促进前列腺癌、胰腺癌和成胶质细胞瘤细胞的存活和侵袭，特别是在以NRP-1依赖方式的癌症干细胞样细胞中。总之，NRP-1在许多肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。

1.3 NRP-1调节神经发育 NRP-1最早是作为神经细胞导向调节因子的受体而被发现，NRP-1是Sema3A最重要的特异性受体之一。Sema3A是一类重要的轴突导向蛋白，引导中枢神经系统中轴突的生长，使其选择正确途径以成功到达靶区，在神经系统的发育过程中对神经元及胶质细胞发挥重要导向作用[11]。NRP-1与Sema3A及丛蛋白形成复合物，共同调控神经生长锥的方向，引导生长锥向着最终的目的地延伸，从而形成精密而复杂的神经网络[2]。除了广泛的神经导向作用之外，通过NRP-1的VEGF激活ERK和AKT信号通路为促性腺激素释放激素(GnRH)细胞的子集提供重要的生理学存活信号，该细胞是脊椎动物正常性腺发育和生育所必需的一类神经元[6,12]。

1.4 NRP-1调节免疫反应 NRP-1在胸腺细胞中表达，调节胸腺细胞的迁移。此外，最近的研究[11]报道，NRP-1还在原始T细胞与树突状细胞(DC)的接触中起作用；并且在免疫系统DC、静息与活化的T细胞上表达，激活DC及T细胞分泌Sema3A，启动初始免疫反应,这提示NRP-1在免疫反应的起始阶段起作用。而在浆细胞样树突状细胞(pDC)中,NRP-1则调节pDC分泌α型干扰素，发挥抗病毒作用。NRP-1还可以介导调节性T细胞(Tregs)到肿瘤部位抑制机体的抗肿瘤免疫。高表达NRP-1的Tregs以VEGF依赖性方式介导这些细胞向肿瘤的浸润，由此促成与癌症相关的免疫抑制，发挥免疫抑制功能，抑制抗肿瘤免疫[13，14]。研究[15]在肿瘤病变和癌症患者的外周血中发现了高水平的Tregs，并且这种增加已被证明与受乳腺癌、胃癌和卵巢癌影响的患者的不良预后相关。Delgoffe等[16]发现NRP-1/信号素4A(SEMA4A)轴在肿瘤浸润Tregs细胞中起关键作用，而在周围Tregs细胞中不起关键作用，仅维持其稳定性，从而逃避抗肿瘤免疫反应。还有研究[16]表明，肿瘤细胞通过分泌Sema3A进而抑制T细胞的增殖及功能，对其进行负性调节，进而达到免疫逃脱。总之，NRP-1通过多种机制在肿瘤细胞逃避免疫监测方面发挥作用。

2 NRP-1在乳腺癌发生发展中的作用

在1998年，Soker等从人乳腺癌细胞系中纯化了NRP-1，并揭示了NRP-1在乳腺癌转移过程中的重要作用。而近年来，研究人员也从不同角度对NRP-1与乳腺癌的相关性进行了分析。陶德友等[17]发现乳腺浸润性导管癌组织中NRP-1的阳性表达率远高于纤维腺瘤和正常乳腺组织。Stephenson等[18]通过对人乳腺正常组织、非肿瘤组织和肿瘤组织样本中NRP-1状态综合分析显示，与正常组织对比，邻近肿瘤的肿瘤组织和非肿瘤组织中的NRP-1 mRNA表达显著增高，同时还发现NRP-1在与肿瘤相邻的非肿瘤性导管中过量产生，但是在从导管增生向导管原位癌或导管癌过渡期间减少，同时肌上皮细胞消失，这表明NRP-1的差异表达可能与分散肌上皮细胞的细胞应答有关。Han等[19]选择高表达NRP-1的乳腺癌细胞系MCF-7和SK-BR-3，基于携带干扰序列的慢病毒载体成功构建了干扰人NRP-1基因的慢病毒载体，通过抑制NRP-1 mRNA和蛋白表达进一步抑制了乳腺癌细胞的增殖并促进了乳腺癌细胞的凋亡。人们还发现在NRP-1阳性而VEGFR-2阴性的乳腺癌细胞系中，通过靶向NRP-1上的VEGF165结合位点的抗NRP-1肽，拮抗VEGF对乳腺癌细胞的自分泌抗细胞凋亡作用，进而促进肿瘤细胞凋亡，并且发现NRP-1的表达水平与细胞存活直接相关。Luo等[20]发现，NRP-1对乳腺癌发生与转移的正调节与上皮间充质转化(EMT)过程有关，并且发现VEGF-A/NRP-1轴可通过促进EMT促进乳腺癌进展。值得注意的是，EMT可以使肿瘤细胞具有干性特征，并且相对于低干性的乳腺癌细胞系MCF-7，NRP-1在高干性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达水平更高，认为NRP-1通过上调EMT过程间接上调了乳腺癌细胞的干性。Fertig等[21]在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中发现NRP-1也是一种潜在的分子，可以靶向有利地改变肿瘤微环境和先天免疫系统，以产生有效的抗肿瘤免疫应答。Vintonenko等[22]通过体外细胞试验发现，在应激条件下VEGF189通过NRP-1诱导乳腺癌细胞凋亡，这进一步揭示了NRP-1在乳腺癌中作用的复杂性。

NRP-1与乳腺癌的发生发展的相关性在很多学者的研究中已经得到了证实，然而其促进乳腺癌发展的具体机制及相关信号通路却还未得到阐明，为了进一步解释上述现象，研究人员试图通过体外细胞试验了解上述过程中可能存在的具体机制及相关信号通路。有学者认为，在恶性乳腺癌细胞中激活诱导的信号传导通路的作用是非常重要的。以前的研究表明，NF-κB和β-连环蛋白通路与调节乳腺癌细胞的迁移和侵袭有关，并受糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)表达的调节。Luo等[23]的实验数据进一步表明，VEGF/NRP-1轴对乳腺癌的发生和转移的正调节可能与NF-κB和β-连环蛋白信号传导有关，但其机制需要进一步阐明。Zhang等[23]通过体外细胞试验证明，VEGF/NRP-1轴通过激活Wnt/β-连环蛋白途径赋予乳腺癌细胞CSCs表型，而不是依赖于VEGF受体。miR-376a作为乳腺癌肿瘤抑制因子，其表达与乳腺癌患者的总体存活率(OS)呈正相关，而在乳腺癌细胞中则显著下降。miR-376a过表达可以抑制细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。Zhang等[24]通过试验表明，miR-376a可以直接靶向NRP-1并使下游Wnt/β-连环蛋白失活，证明miR-376a通过靶向乳腺癌中的NRP-1而充当肿瘤抑制剂。此外，人们还发现许多转录调节因子作用于NRP-1的下游，例如转录抑制因子Snal1，它对于细胞分化和存活至关重要，可逆转TGF-β在早期乳腺癌中诱导的肿瘤抑制作用[25]。糖蛋白神经介素B(GPNMB)是许多癌症的恶性表型，Maric等[26]发现，在乳腺癌细胞中GPNMB通过NRP-1诱导乳腺癌肿瘤细胞的生长，但对肿瘤细胞的转移却不是必须的。还有研究[27]发现，在乳腺癌细胞中NRP-1过表达可引起载脂蛋白D(ApoD)表达的下调，而ApoD表达下调被证明与高级别进行性浸润性乳腺癌有关。Bachelder等[28]的研究发现，VEGF可以支持表达NRP-1的乳腺癌细胞的存活，同时还发现表达NRP-1的乳腺癌细胞系MDA-MB-453可以免于缺氧诱导的细胞凋亡，并阐明了NRP-1在乳腺癌转移细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435中表达，但在非转移细胞系MDA-MB-453中不表达，这表明NRP-1可能是乳腺癌转移的重要决定因素。

以上研究结果为NRP-1促进乳腺癌的发生发展提供了有力的直接证据，表明NRP-1可能是人乳腺中的一种多功能蛋白，在乳腺癌的发生发展中有复杂且多样的作用，与乳腺癌的生物学行为密切相关。NRP-1可能参与诱导肿瘤和血管生成的局部侵袭，并与乳腺癌的进展有直接关系。这种肿瘤细胞来源的NRP-1在功能上是有活性的，并且可以在存在或不存在VEGF时充当肿瘤血管生成的正调节剂和肿瘤细胞凋亡的负调节剂[18]，提示NRP-1的过量产生以及差异分布可能与乳腺癌的临床分期、侵袭转移有关，这表明NRP-1也可能是一种癌基因，与乳腺癌预后密切相关，是乳腺癌患者重要的独立预后因素[29]。

3 NRP-1在乳腺癌诊断中的作用

分子成像是乳腺癌的早期检测、分期以及评估治疗反应的有前景的方法。郭凯峰等[29]通过动物试验发现，乳腺癌靶向肽CLKADKAKC(CK3)为NRP-1靶向肽，具有乳腺癌单光子发射计算机断层成像术(SPECT)和近红外荧光成像的潜力，并且CK3不会积聚到肺和心脏中。这种新型NRP-1靶向肽代表了乳腺癌诊断、分期和评估治疗反应的新途径。此外，Naik等[25]发现NRP-1是血液中的一种相关分子，可以对具有不良预后的乳腺癌进行区分。

4 NRP-1在乳腺癌治疗中的作用

近年来对乳腺癌的治疗综合手术、放化疗及靶向治疗等方法，但是预期结果并不理想。贝伐珠单抗是针对VEGF人源化单克隆抗体，是靶向VEGF的典型代表药物。但有研究[30]表明，贝伐珠单抗并没有使乳腺癌患者的总生存率显著提升，且长期使用会出现高血压、出血、器官损伤甚至心脏衰竭等一系列严重的不良反应。此外，当用激素治疗其他乳腺癌亚型肿瘤时，治疗耐药性也很常见。近年来，对乳腺癌管理的广泛研究已经推动了细胞毒性治疗和生物驱动的靶向治疗的发展，这有助于提高乳腺癌患者的生存率，但是尽管乳腺癌管理有所改善，但在诊断和治疗预后不良的乳腺癌类型、克服肿瘤异质性方面仍存在挑战。因此，我们急需寻找新的治疗方法，以增加乳腺癌肿瘤的额外的分子因子靶点[21,30]。因此，验证合适的生物标志物、以个性化的方式精确调整治疗方案的选择是目前在乳腺癌治疗中一个高度优先考虑的问题。

NRP-1作为一个多功能受体，与乳腺癌的发生发展、转移及免疫均有一定的相关性，在乳腺癌治疗中可作为抗癌药物的新靶点，特别是其作为VEGF的共受体在肿瘤组织血管生成中的作用，可以在抗肿瘤血管生成中提供一个很好的靶点[31]。此外，在乳腺癌治疗中的耐药现象是一个非常棘手的问题。最近的研究[32,33]表明，CSCs是导致耐药性的主要因素，CSCs还可以修复损伤的乳腺癌细胞。在乳腺癌中，VEGF-A/NRP-1轴通过激活Wnt/β-连环蛋白途径赋予肿瘤细胞CSCs表型。这种新的信号传导可为临床实验中使用VEGF-A/NRP-1抑制剂如EG00229提供理论依据。参考NRP-1在GPNMB介导的原发性乳腺癌中的作用,针对GPNMB的临床实验中的治疗剂可以与针对NRP-1或GPNMB的核心结构域RGD结合整联蛋白的药剂偶联，以更好地控制表达高水平GPNMB的乳腺癌[26]。此外，参考miR-376a在NRP-1调节乳腺癌进展中的作用，可以将miR-376a的激活作为一种潜在的新型治疗策略来特异性抑制乳腺癌进展[24]。

此外，NRP-1在激素不敏感的三阴性乳腺癌(TNBC)的治疗中有着更为广阔的发展前景。TNBC是一种预后不良的乳腺癌亚型，由于缺乏有效的分子靶点，有效管理这一亚型的治疗方案有限，而GPNMB则是其潜在的高表达靶点，靶向GPNMB细胞外结构域的药物正在乳腺癌患者的临床实验中进行评估，而NRP-1作为其在乳腺癌的中间作用分子，NRP-1在乳腺癌特别是TNBC的靶向治疗中的有着不可预估的研究前景。并且研究人员发现，NRP-1有助于增加TNBC的化疗敏感性[19,27]。

综上所述，NRP-1作为一种跨膜糖蛋白，在血管生成、肿瘤的发生发展、神经发育、免疫调节等过程中发挥着重要作用，并且在乳腺癌的发生发展中也扮演着重要的角色。随着对NRP-1与乳腺癌相关性研究的不断深入，NRP-1在乳腺癌的诊断与治疗中的作用也进一步被发掘，这为乳腺癌的诊治提供了新的思路。