嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗急性髓系白血病的临床试验进展

赵芮 王亮

1南方医科大学第二临床医学院（广州 510282）；2南方医科大学珠江医院血液内科（广州 510282）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是髓系造血干/祖细胞恶性疾病，是成人白血病最常见的形式。过去30年来AML治疗仅有轻微改变，预后仍然较差[1]。因AML的高度异质性，临床已采用针对特定基因突变的分子靶向药物与化疗药物联合的治疗方案：如FMS样酪氨酸激酶3（fms-like tyrosine kinase 3，FLT3）、BCL2抑制剂、异柠檬酸脱 氢 酶 1/2（isocitrate dehydrogenase1/2，IDH1/2）抑制剂、NMD2抑制剂等分子靶向药物联合化疗药物治疗AML，表明了靶向治疗的可行性与有效性[2-4]。临床仍需新型且具有成本效益的前期治疗以诱导AML缓解及预防其复发，还需适用于患者复发和等待移植期间的桥接疗法以改善其预后。

T细胞介导的适应性免疫是通过CD4+和CD8+T细胞的T细胞受体与抗原递呈细胞提呈的肽-主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）配体结合从而激活多种信号传导途径和转录因子，使T细胞增殖并发挥杀伤肿瘤细胞功能[5]。但随着参与抗原递呈的MHC类基因表达下调，可导致免疫逃逸致使AML进展或复发[6]。嵌合抗原受体修饰的T细胞（chimeric antigen receptor engineered T cell，CAR-T）治疗是将一种或多种特异性CAR表达于患者的T细胞使其可靶向消灭肿瘤细胞的过继免疫疗法。植入CARs的T细胞可进行非MHC依赖性抗原识别，从而有效地绕过肿瘤的主要免疫逃逸机制，如蛋白酶体抗原加工和MHC分子的下调等，从而特异性杀伤肿瘤细胞[7]。

目前CAR-T在治疗多发性骨髓瘤、外周T细胞淋巴瘤、AML的临床前评估中被证实有效，临床常用的CD19 CAR-T细胞在治疗急性B淋巴细胞性白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）及B细胞恶性淋巴瘤的临床试验中也已取得较满意的疗效，从而激起研究者将CAR-T治疗应用于更多血液肿瘤临床试验的兴趣[8-10]。本文重点介绍近5年内CAR-T治疗AML的临床研究进展。

1 CAR的结构

典型CAR受体包括胞外区、跨膜结构域及信号转导域。胞外区由信号肽、抗原识别区及铰链区组成。目前常用跨膜结构域通常来源于Ⅰ型膜结合蛋白，如 CD4、CD8、CD28、CD3ζ或 FcεRIγ等。胞内信号转导结构域含有第二活化信号，目前常用的结构域包括具有刺激CD8+中央记忆型T细胞生长、增强糖酵解代谢作用的CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）、ICOS和CD27等[11]。根据胞内信号转导结构域的不同可将CAR分为4代：一代CARs由单链抗体（single-chain antibodies，scFv）与包含3个免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-Based activation motif，ITAM）的CD3ζ连接构成[12]；为了提高信号转导的强度，二代CARs的胞内信号转导结构域包含一个共刺激因子；三代CARs的胞内信号转导结构域则包含两个共刺激因子；最新的四代CAR-T细胞（T cells redirected for universal cytokine killing，TRUCKs）在二代CARs的基础上增加了可激活T细胞表达转基因产物如IL-12等细胞因子的核因子以增强T细胞活化，调节肿瘤血管和免疫微环境，但TRUCKs目前仍处于测试阶段，临床试验记录不足[13]。由于CAR细胞的结构特点，CAR-T细胞可介导细胞毒性T细胞（cytotoxic T-lymphocytes，CTLs）特异性杀伤肿瘤细胞。

2 CAR-T细胞的采集及制备

对于大多数患者来说，从外周静脉血分离单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）为CAR-T细胞制备收集足够数量的CD3+细胞（＞ 0.6× 109）是安全可行的[14]。为提高CAR-T细胞浓度，在PBMCs分离过程中可加入磁性颗粒联合单克隆抗体靶向选择CD4+和CD8+细胞，减少外周血单核细胞和粒细胞含量；或采用流式细胞术分选出AML原幼细胞从而提高富集PBMCs浓缩物的T细胞产量[15-16]。待得到足够数量的T细胞后，可在体外应用慢病毒、SB转座子系统或电穿孔将编码CAR的DNA或mRNA转染入T细胞内从而获得细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK）[17]。待得到足量CAR-T细胞后，可将其分一次或多次回输至患者体内，CAR-T细胞的效能并不随其剂量增加而递增，回输入患者体内的CAR-T细胞数量可参考美国重组DNA咨询委员会的推荐剂量[18]，通常可在CAR-T回输前1～3 d应用环磷酰胺和氟达拉滨进行预处理以消耗体内其淋巴细胞，提高CAR-T的有效性和持久性，并减少其毒性反应[19]。回输后可通过定量聚合酶链式反应检测骨髓或外周血中细胞复制数、单光子发射计算机断层成像术（single-photon emission computed tomography，SPECT）以检测体内In111标记的CAR-T细胞等方法评估其体内运输和持久性[20]。

3 CAR-T细胞在AML的临床应用

目前针对B-ALL的CAR-T细胞治疗临床上应用最广泛的靶点为CD19，在CAR-CD19 T细胞治疗难治复发性B-ALL的随访中，83%的患者可达到完全缓解，受试患者的中位总生存期可达12.9个月（8.7～23.4个月）[21]。因CAR-T细胞在治疗B-ALL中已证实其有效性、安全性，因此CAR-T细胞也被用于治疗AML的临床研究中。

因AML起源于白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs），因此消除LSC细胞是治疗AML的重要目标[22]。LSCs表面表达与正常骨髓造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC）相 似 的 抗 原 如CD34++CD38--，除此之外LSCs表面还表达CD33、CD123、CD44、CD13、CLL-1、CD96、TIM3、CD47、CD32和CD25等抗原，并不是每一个LSC细胞均可同时表达上述所有抗原，且某些抗原也表达于正常HSC表面[23]。EHNINGER等[24]通过流式细胞术检测了319例AML患者LSC表面抗原，发现87.8%的AML表达CD33，9.4%的AML患者表达CD123而没有表达CD33，69.5%的患者中观察到同时存在两种抗原。

3.1 CD33CD33主要表达于骨髓多能前体细胞、单能集落形成细胞、Kupfer细胞和肝细胞等细胞表面，且87.8%的AML患者骨髓细胞表面表达CD33[24]。临床上已证实由靶向CD33的单克隆抗体与calicheamicin组成的吉妥珠单抗-奥唑米星（gemtuzumab ozogamicin，GO）可改善AML患者生存率，且对于诱导化疗失败的患者而言，含GO的化疗方案的有效率达50%，因此CD33可作为治疗AML的有效靶点之一[25]。体外的临床前研究已证实了CD33 CAR-T细胞治疗AML的可行性，因此CD33 CAR-T细胞也被应用于治疗AML的临床研究中[26]。WANG等[27]临床试验表明 CD33 CAR-T细胞治疗AML的持久有效性及安全性仍需进一步提高以应用于治疗AML的临床试验。

3.2 路易斯抗原（Lewis Y antigen，LeY）LeY是核心由四个己糖单元组成识别元件的胚胎抗原，在AML患者骨髓中表达率达46%且在正常组织中很少表达，因此LeY抗原可作为CAR-T细胞治疗的靶点[28]。有研究者等[20]将纯度为14%～38%的总计5×108～1.3×109结构为LeY-scFv-CD28-CD3ζ的CAR-抗LeY T细胞回输至4位试验前已接受氟达拉滨和阿糖胞苷治疗的难治复发AML患者体内。接受CAR-T细胞输注患者患者在治疗期间均未发生3～4级细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS），但CAR-T细胞回输48 h后部分病例血清中IFN-γ和IL-2升高后下降，甚至出现病理组织学显示有CD8+和AML原始细胞浸润的皮疹（CD4+CD8+）、发烧及寒战反应。患者虽复发但骨髓LeY抗体表达并未下降，因此推测AML复发与CAR-T细胞转基因表达下调或患者产生免疫抑制环境有关。

3.3 NKG2DNKG2D是一种在NK细胞和活化的CD8+细胞表面表达的激活性受体，其识别配体为MICA/B和UL-16结合蛋白家族（ULBP1-6）。HILPERT等[29]证实MICA/B或ULBP1-3存在于74%AML患者的骨髓原始细胞上，且试验表明采集和生产自体NKG2D CAR-T细胞的可行性，因此临床开始进行NKG2DL CAR-T细胞治疗AML的尝试[30]。

SALLMAN 等[31]和 BAUMEISTER 等[32]的临床试验结果证明了NKG2DL CAR-T细胞治疗AML安全有效，无CRS、神经毒性及脱靶效应等毒性作用发生。但BARAGAÑO等[33]研究表明随着AML患者病情进展，NKG2DL可能被DNA甲基化导致表达沉默致使免疫逃逸。因此未来仍需更多临床试验去验证NKG2DL是否可作为合适的CAR-T细胞治疗靶点。

3.4 C型凝集素样分子-1（c-typelectin-like molecule-1，CLL-1） CLL-1是Ⅱ型跨膜糖蛋白抑制性受体，92%的AML样本CLL为阳性同时CLL-1不在HSC上表达，仅在粒细胞和前体单核细胞表面高表达，且CLL-1和CD33共同表达于95%AML样品表面，因此CLL-1和CD33可联合作为治疗AML的靶点[34]。在临床前试验中，CLL-1 CAR-T细胞可杀伤AML细胞同时对HSC细胞无毒性作用，证实了CLL-1作为治疗AML靶点的可行性与安全性[35]。LIU[36]在第60届ASH年会上口头报道了1例CLL1-CD33 cCAR-T细胞治疗AML的一期临床试验结果，该患者为6岁儿童，曾患有范可尼贫血并最终进展为FLT3-ITD基因突变的AML，该患者接受氟达拉滨和环磷酰胺的预处理方案后连续2 d输注1×106/（kg·d）CLL1-CD33 cCAR-T细胞。输注12 d后该患者骨髓原始细胞比例由81%升至98%，但于第19天，该患者骨髓原始细胞消失并达到微小残留病变完全缓解。该报道证明了CLL1-CD33 cCAR-T的安全性及有效性，为进一步开展CAR-T细胞治疗AML的临床试验提供了理论依据。

细胞及动物临床前实验中也证实了CD123[37]、Wilms Tumor 1[38]、CD44v6[39]、folate receptor beta[40]、CD117[41]、CD38[42]、FLT3[43]及 PR1[44]可作为治疗AML的靶点，未来有望在临床试验中开展嵌合上述靶点的CAR-T细胞治疗AML的临床试验以获得更有效的治疗方案。

4 结语

综上，在治疗AML的临床试验中已证实CAR-T细胞具有体内扩增快、持续时间长等优势。CAR-T细胞已成为治疗B-ALL及B细胞恶性淋巴瘤的主要方法之一，但在治疗AML的临床应用中仍存在效能不足、特异性低等问题。截止目前clinicaltrials.gov所登记的CAR-T细胞治疗AML临床试验共有21项且已含有UCAR-T 123细胞。CAR-T细胞治疗AML的临床试验样本量仍较少，疗效仍不确切，目前需要开发治疗AML的有效靶点及更多的临床试验来提高CAR-T细胞对AML杀伤活性及特异性，相信未来克服了细胞毒性作用及提高疗效的CAR-T细胞有望成为诱导AML缓解、预防AML复发并可用于复发型AML患者等待移植期间的有效桥接方法。