杜氏型肌营养不良症治疗进展

张 淑，吴士文

杜氏型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一种X连锁隐性遗传疾病，发病率约1/5 000活产男婴[1]。致病基因为Dystrophin蛋白编码基因，位于Xp21.2-p21.1，含79个外显子，编码427 kDa的抗肌萎缩蛋白。抗肌萎缩蛋白与一系列骨架蛋白结合形成肌营养不良相关蛋白复合物(Dystrophin-associated protein complex,DAPC)，维系细胞膜的稳定和功能，保护肌纤维膜免受肌肉收缩时可能产生的损伤。大多数DMD患者基因突变为框外突变或无义突变等形式，导致转录水平降低，翻译出截短的无功能的蛋白。抗肌萎缩蛋白缺失导致肌纤维收缩时细胞膜破裂及细胞内信号传导受损，增加肌膜脆性，钙离子内流及钙稳态失衡，激活蛋白酶和促炎细胞因子，线粒体功能障碍[2]，血管适应性受损，一氧化氮合酶位移，氧化应激增加和修复失败[3]，因此，病理上表现为肌肉坏死、变性及再生，肌纤维萎缩，脂肪化及炎症。临床上表现为进行性肌肉力弱及萎缩，晚期累及全身多系统。大多数患者2～5岁时出现运动功能发育延迟，如不及时治疗，8～12岁丧失独立行走能力，约在20～30岁死于心肺功能衰竭。目前DMD尚无治愈办法，来自TREAT-NMD及国际肌营养不良协会的国际标准照料指南推荐多学科联合门诊综合治疗及护理，提高患者生活质量，延长患者生命。标准照料包括肌肉系统、骨关节系统、内分泌系统、胃肠道营养、呼吸系统、心血管系统、心理治疗及处理。本文着重介绍DMD相关的药物治疗及近年来蓬勃发展的新兴治疗，以帮助延缓DMD疾病进展。

1 一般治疗

DMD全球标准照料指南于2010年发布，2018年更新，目的是规范全球DMD患者的照料和护理。随机对照试验表明，糖皮质激素可改善DMD患者的肌肉力量和呼吸功能[4]，显著延长独立行走时间，减少心肺功能下降，降低脊柱侧凸的风险，延长患者寿命[5]。指南推荐所有DMD患者应用糖皮质激素，建议泼尼松0.75 mg/(kg·d)或地夫可特0.9 mg/(kg·d)口服，也可采用间歇给药方案[6]。目前的共识要求在运动功能减退前启动糖皮质激素治疗，且在丧失独立行走能力后继续治疗仍可延缓心肺功能恶化和减缓脊柱侧凸进展[7-8]。如果发生较难处理或不可耐受的糖皮质激素不良反应，不能突然停用。激素剂量应每2周减少原来剂量的25%～33%，一旦达到每天生理剂量泼尼松3 mg/m2时，应改为氢化可的松12 mg/(m2·d)，直至减至2.5 mg/d，然后隔天给药1次，2周后停药。减量过程中，每个月重新评估1次，监测促肾上腺皮质激素释放激素水平。在丧失独立行走能力的患者中依据不良反应耐受情况可适当减少剂量。对于从未服用过激素的患者，即便在丧失独立行走能力后再开始激素治疗仍可获益[9]。也有研究认为，在疾病早期、没有运动功能下降前开始激素治疗也可获得肯定的益处[10]。糖皮质激素最常见的不良反应是体重增加和类库欣综合征。身材矮小、肥胖和白内障也是比较常见的不良反应[11]。另外，椎体及长骨骨折风险发生率较高[12]。规律运动、高钙饮食、补充维生素D及定期监测双能 X 线吸收测定 (DEXA) 扫描的骨密度是骨骼系统健康管理中的重要部分。静脉注射双膦酸盐适用于无症状的中度和重度椎体骨折，以及症状性椎体压缩性骨折[13]。建议早期使用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)或β受体阻滞剂，以延缓 DMD心肌病的进展。醛固酮拮抗剂依普利酮联合ACEI治疗也能延缓射血分数保留的 DMD 患者左心室收缩功能的下降[14]。5～6岁开始，应每年进行1次呼吸系统评估，丧失独立行走能力患者每 6 个月进行1次，以发现呼吸功能不全的早期体征。尤其是糖皮质激素治疗致体重增加明显时，应考虑进行夜间脉搏血氧测定或二氧化碳图睡眠监测。用力肺活量 (FVC) 小于 50% 预测值、最大吸气压力绝对值小于60 cm H2O、二氧化碳分压 (PCO2) 大于45 mmHg或基线血氧饱和度 (SpO2) 低于室内空气的 95%，应及时开始夜间无创正压通气(Non-invasive positive pressure ventilation，NIPPV)，当通气不足和高碳酸血症的症状或体征持续存在时，需要增加日间通气支持[13]。除常规免疫接种外，还应提供肺炎球菌和三价灭活流感疫苗预防。依据2018年疾病标准照料指南，还应对DMD患者常规进行生长监测和健康监测，并及时给予营养支持及指导，同时应给予积极的心理治疗干预及其他对症治疗。

2 基因治疗

DMD基因治疗的目的是使患者肌肉组织产生具有部分功能的抗肌萎缩蛋白。在Clinicaltrials.gov查询：1995-2018年，一共有127项临床试验，57%为药理学试验，28%为基因治疗(22%为基于反义寡核苷酸技术的外显子跳跃治疗，6%为AAV基因补充)，3%为基于细胞的治疗方法[15]。

2.1 以病毒为载体的Dystrophin基因替代治疗 基因替代治疗是将外源遗传物质转入宿主细胞以纠正突变的基因。该方法首先分离目的基因，基因修饰后注入细胞核，纠正突变细胞。DMD的基因治疗中，需要将新的抗肌萎缩蛋白基因导入全身肌肉，主要问题是抗肌萎缩蛋白基因大小。Dystrophin的cDNA为14 kb，远远超过腺相关病毒 (AAV)小于5 kb的承载能力。DMD基因庞大导致了该病基因替代治疗的复杂性。新近的研究通过选择目标区域创建小型或微型肌营养不良蛋白，初步解决了基因替代治疗的问题。AAV载体用于将DMD基因的较小但有功能的拷贝导入肌纤维。其优点包括延长基因的表达时间，不独立复制，可感染分裂和非分裂细胞[16]。向DMD犬模型注射携带小型/微型肌营养不良蛋白的AAV载体，改善了肌肉组织蛋白的表达[17]。然而，在一项人体研究中，6例DMD男孩注射了AAV相关的小型肌营养不良蛋白基因，由于对小型/微型肌营养不良蛋白发生了非预期的T 细胞介导的免疫反应，转基因表达失败[18]。重组 AAV 载体和更高效的载体递送系统正在研究中。目前Solid和Sarepta 已发布中期数据，Sarepta高初始剂量[2×1014载体基因组 (vg)/kg]治疗90 d后呈现了较好的疗效，4例患者肌肉活检显示，肌营养不良蛋白免疫荧光染色81%的纤维阳性，同时血清肌酸激酶水平、北极星评估以及计时功能测试均有所改善。Solid报告基因表达水平较低，但与其较低的初始载体剂量基本保持一致[19]。Pfizer于2019年6月28日PPMD年会上也宣布PF-06939926的初步结果，AAV-minidystrophin治疗2个月后分别在低剂量组和高剂量组观察到38%和69%的阳性蛋白表达。

2.2 外显子跳跃治疗 外显子跳跃治疗是DMD另外一个有前景的治疗策略。外显子跳跃是指在DMD基因的前信使 RNA 剪接过程中，通过使用反义寡核苷酸序列(Antisense oligonucleotide，AON)跳过某些外显子，框外突变转变为框内突变，从而产生具有部分功能的截短的肌营养不良蛋白，使临床表型为DMD的患者转变成比较温和的Becker型肌营养不良(BMD)。AON被设计为不同的化学骨架分子结构，如肽核酸、2′-O-甲基-硫代磷酸寡核苷酸或二酰胺基吗啉寡聚物[20]。所有缺失突变的DMD患者中，约83%的患者可被外显子跳跃治疗[21]。Drisapersen即PRO051，是一种DMD基因外显子51的2′-O-甲基-硫代磷酸寡核苷酸。在一项大型Ⅲ期临床试验中，186例DMD男孩接受 9 mg/kg 剂量治疗，与安慰剂相比，6分钟步行试验(6 minutes walk test，6MWT)无显著改善。然而，6MWT基线为 300～400 m亚组分析中，卧立位时间显示了统计学上的显著改善[22]。在年龄较小的DMD男性患儿(平均年龄7.3岁)中进行的一项Ⅱ期研究中，每周 9 mg/kg 剂量Drisapersen连续给药25周，可见6MWT改善和Dystrophin蛋白表达增加，但在第49周时改善没有持续。Drisapersen耐受性良好，不良反应仅有注射部位局部反应、一过性蛋白尿和发热[23]。Eteplirsen (AVI-4658)是一种专为外显子 51 跳跃设计的二酰胺磷酸吗啉基低聚物，可治疗大约 13% 缺失突变的DMD男性患儿[24]。Eteplirsen Ⅱ/Ⅲ期临床研究的结果加速了美国食品药品监督管理局(FDA)的批准。在一项双盲安慰剂对照试验中，12例7～12岁的DMD男孩分别应用Eteplirsen 30 mg/kg或50 mg/kg,每周1次，连续治疗24周，随后是开放扩展治疗。在步行能力明显改善和临床功能稳定的患者肌肉活检中发现了抗肌萎缩蛋白和抗肌萎缩蛋白糖蛋白复合物[25]。6例经过外显子51跳跃的患者4年后6MWT增加了165 m[26]。Eteplirsen 也成为FDA批准的第1个用于治疗DMD的基因药物，目前关于Eteplirsen 的剂量逐渐递增的开放研究也正在招募患者中。Tricylo-DNA是一类新的AON的成员，在外显子23跳跃 mdx小鼠中可有效地恢复骨骼肌、心脏和大脑中蛋白的表达[27]。

目前的外显子跳跃治疗具有心肌疗效低、细胞摄取差、循环系统清除快等局限性，需要频繁给药才能达到治疗目标。为了提高效价和传递，一些新的改良策略如改善AON的结构和剂量输注方法等都在研究中。多外显子跳跃治疗使mdx犬模型功能得到改善[28]。然而，这些新的外显子跳跃策略在人体试验前都需要进一步的毒理学研究。

2.3 终止密码子通读治疗 无义突变是单碱基突变导致终止密码子提前出现，核糖体亚单位解离并终止蛋白质翻译，DMD无义突变患者占总患者人群的10%～15%[29-30]。无义突变通读疗法是通过与核糖体结合，阻止原终止突变信号的识别，从而跳过这个错误的终止子，诱导这些提前出现的终止密码子通读，从而继续翻译出全长的抗肌萎缩蛋白。在mdx小鼠中，庆大霉素等抑制无义突变的药物可诱导肌膜中肌营养不良蛋白的高表达，增加抗收缩诱导的损伤能力[31]。然而，人体试验的结果与动物实验的结果相互矛盾。虽然在庆大霉素治疗6个月的研究中发现抗肌萎缩蛋白表达增加和血清肌酸激酶水平降低，但最大收缩力量和计时功能测试没有显著改善[32]。且耳和肾毒性也限制了庆大霉素在 DMD 治疗中的应用。另一种氨基糖苷类药物Arbekacin正在Ⅱ期试验中，尚需进一步临床试验验证有效性和不良反应[30]。依据庆大霉素和核糖体结合可以跳过无义突变引起蛋白质继续翻译，研究者从数十万小分子化合物中筛选出一种跳过无义突变能力比庆大霉素强、而不良反应比庆大霉素小的化学分子，即PTC124，Ataluren，商品名Translarna。早期一项治疗前后的比较研究发现，PTC124可使抗肌萎缩蛋白表达增加 11%[33]。Ⅱb期双盲安慰剂对照研究中，174例无义突变DMD 的男性患儿接受了为期 48 周的PTC124治疗。结果40 mg/(kg·d)剂量治疗组比对照组平均 6MWT 距离增加了30 m。在接受更高剂量80 mg/(kg·d)的患者中没有观察到明显改善，这可能与PTC124的钟形剂量效应曲线有关[34]。自2014年8月起，欧洲药品管理局批准了PTC124的条件性上市[35]。不同人种的更大样本量的验证性试验(NCT02090959)正在进行，中国区域的PTC124的随机双盲Ⅲ期临床试验研究正在进行中。

2.4 基因组编辑技术 CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)蛋白是一类利用CRISPR序列指导基因组剪切的酶。通过非同源末端连接去除 DNA 片段或通过同源定向修复添加/替换 DNA片段。CRISPR基因组编辑技术具有治疗DMD的潜在价值，小型/微型肌营养不良蛋白是Dystrophin蛋白的截短版本，通过CRISPR可将DMD变成轻度BMD。RNA引导的成簇规律间隔短回文重复序列9 (CRISPR/Cas9)系统允许在体外和体内研究中进行高效的 DMD基因组编辑[36]。利用 AAV 载体，CRISPR/Cas9在mdx小鼠中显示了较好的功能恢复，以及骨骼肌和心肌细胞肌营养不良改变的逆转[37]。有报道，在外显子 50 缺失导致的DMD犬模型中进行 AAV 基因治疗后，利用CRISPR 技术成功完成了外显子的跳跃治疗[38]。值得关注的是，AAV9治疗DMD狗模型取得了成功。其肌肉注射后6周或全身给药8周后，不同的肌肉可表达正常健康水平DMD蛋白的3%～90%。在接受最高治疗剂量AAV9狗的心肌中，DMD蛋白水平达到正常水平的92%[38]。研究显示，以反式剪接AAV为载体，载入腺嘌呤碱基编辑器(ABE)修饰 Cas 蛋白，用于无义突变mdx小鼠可引起单核苷酸成功编辑[39]。然而，临床上许多突变需要移除多个外显子，需要多次同时切割、去除大片段 DNA 和随后的末端连接，而不是简单地单个剪切位点剪切，技术难度更大。为了提高疗效和探索与体内 CRISPR 相关的免疫问题[40]，目前很多公司都在研发关于DMD的临床前CRISPR 疗法，包括 Exonics Therapeutics、CRISPR Therapeutics、Sarepta Therapeutics 和 Editas Medicine等。人体临床试验尚未进行。AAV载体使用CRISPR/Cas9编辑DMD基因的特定区域，可带来骨骼肌和心肌中肌营养不良蛋白的广泛表达[41]。

3 肌肉生长和修复

3.1 干细胞和成肌细胞移植 肌卫星细胞是骨骼肌的成体干细胞，位于肌纤维基膜和肌膜之间。在健康肌肉中，卫星细胞保持静止状态，运动或创伤等诱因可激活，激活后卫星细胞进入细胞周期，快速增殖生成肌源性祖细胞，也称为成肌细胞，随后与受损的肌纤维融合在一起，再生和修复损伤的肌肉[42]。肌卫星细胞对DMD患者疾病进展的作用机制目前仍不清楚。一个被接受的观点是肌肉变性和再生的不断重复引起了肌肉干细胞肌卫星细胞的耗竭，最终卫星细胞无法跟上营养不良肌肉的高再生需求，最终导致再生能力的丧失[43]。同时，有多项研究发现，肌营养不良患者及mdx小鼠肌肉中观察到卫星细胞数量增加[44]，这些结果表明，疾病处于不同的病程中，表现可能不完全相同，且肌营养不良的再生能力受损不能简单地归因于肌肉干细胞的耗竭。

干细胞治疗 DMD 的长期安全性和有效性仍不清楚，患者来源的多能干细胞提供了无限自体干细胞的潜力，这些细胞在移植前需要遗传校正[45]。最近的一项临床试验中，5 例男孩动脉内移植人类白细胞抗原匹配的同胞供体中血管壁相关的间充质干细胞，耐受性良好，但肌肉活检发现供体DNA水平低，未显示功能获益[46]。

3.2 Utrophin调节 Utrophin是Dystrophin的常染色体类似物，是细胞骨架的一个组分，2种蛋白之间有80%的相似性。在成人中，通常位于肌腱和神经肌肉接头(NMJ)处，而在胎儿发育过程中，在Dystrophin 表达之前定位于肌膜上[47]。肌肉损伤可引起Utrophin上调，Utrophin在DMD患者中表达增加，但未达到能够代偿肌营养不良症状的程度[48]。2-芳基安息香硫酸盐调节剂Ezutromid可增加mdx小鼠的Utrophin,改善肌肉力量，减少运动后的肌肉疲劳。在一项Ⅰ期临床试验中，以 100 mg/kg 剂量的Ezutromid 治疗11 d后，在骨骼肌和心肌中均发现Utrophin 水平升高[49]。在 mdx 小鼠中，肝素治疗 4 周增加了Utrophin水平，肌力增加，但尚无人体数据[50]。最近的研究表明，AAV-microutrophin 可调节 DMD 小鼠模型的骨骼肌和心肌病理上的蛋白表达[51]。依照相同的治疗策略思路，GALGT2蛋白高度定位在成人骨骼肌的神经肌肉和肌腱连接处，GALGT2 编码β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶，使骨骼肌中的肌聚糖糖基化，当使用肌肉特异性转基因小鼠或 AAV 介导的基因治疗过表达时，可以抑制骨骼肌病理的发展。在mdx和野生型小鼠骨骼肌中过表达GALGT2 可以防止离心收缩引起的肌肉损伤[52]。而 GALGT2在 DMD 模型中，骨骼肌的潜在治疗作用已得到充分研究，但其预防心功能丧失或心肌病变的能力尚不清楚。缺乏内源性 GALGT2的小鼠在 WT 和 mdx 背景下心脏功能均随着年龄增长而减弱，但尚未进行心脏研究来评估 GALGT2 过表达的潜在治疗价值[53]。

4 对症治疗

4.1 抗氧化剂和抗炎药 艾地苯醌是一种具有抗氧化特性的苯醌，可能延缓 DMD 呼吸衰竭的发生[54]。Ⅱa期DELPHI研究比较了艾地苯醌(450 mg/d)与安慰剂治疗的8～16岁DMD 患者，艾地苯醌治疗组的平均呼气流量峰值百分比显著改善，且与糖皮质激素治疗的患者相比，艾地苯醌+糖皮质激素治疗的患者平均呼气流量峰值增加更多，提示艾地苯醌对使用激素治疗的患者有更好的疗效[55]。DELOS研究是一项为期52周的艾地苯醌(900 mg/d)治疗DMD患者的随机试验，结果显示，艾地苯醌组的平均呼气流量峰值等肺功能指标下降较安慰剂组明显减缓[56]。

Vamorolone(VBP15)是一种解离糖皮质激素受体配体，在动物模型中显示了皮质类固醇的抗炎功效，而没有类固醇的不良反应。NF-κB的有效抑制是通过糖皮质激素受体的蛋白质相互作用介导的，VBP15显示出显著降低激素受体的转录活性。通过预防性和发病后干预，其可改善DMD模型小鼠肌肉力量和病理学表现，且不引起免疫抑制或激素不良反应[57]。目前，几项Ⅱ期试验(NCT02760264、NCT0303839-9、NCT02760277)正在研究 VBP15在DMD患者中的安全性和有效性。一项Ⅲ期试验(NCT02814019)正在招募患者。DMD患者中，NF-κB信号途径在肌纤维和免疫细胞中持续升高。CAT-1004(依达拉奉)可抑制活化的NF-κB信号途径。在一项Ⅰ期安全性研究中，依达拉奉治疗2周后NF-κB显著下降，轻度不良反应包括腹泻和头痛[58]。某些潜在抗炎治疗，包括乙酰半胱氨酸、绿茶提取物、褪黑素和己酮可可碱等药物的研究结果还不确定。

4.2 Myostatin 抑制剂 Myostatin即肌肉生长抑制素，是转化生长因子-β(TGF-β)配体家族的成员，是骨骼肌质量的负调节剂。肌肉生长抑制素的缺失可增加正常和营养不良小鼠的肌肉质量并改善肌肉功能。因此，通过特异性抗体阻断肌肉生长抑制素可以通过增加骨骼肌质量和功能来改善DMD患者的肌肉无力，从而减少患者的功能衰退。在mdx小鼠中，鼠抗肌生长抑制素抗体mRK35及其人源化类似物Domagrozumab使趾长伸肌和胫骨前肌的质量和力量明显增加[59]，但后期的人体临床试验因治疗效果不显著均被提前终止。组蛋白去乙酰化酶抑制剂如Givinostat 可增加 mdx 小鼠的肌肉再生并降低肌肉纤维化[60]。在为期 12 个月的Givinostat 治疗 DMD 患者的 Ⅱ 期研究中，肌纤维面积分数显著增加，总纤维化、坏死和脂肪组织替代显著减少。一项Ⅲ期研究将在非卧床的DMD患者中评价Givinostat的疗效。其他肌肉生长抑制素抑制剂包括卵泡抑素(NCT01519349)、PF-06252616(NCT02310763、NCT02907619)和 BMS-986089(NCT02515669)的研究正在进行中。

4.3 粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,GCSF) GCSF是一种诱导骨髓释放干细胞的细胞因子，特别是在肌肉损伤后。这些干细胞诱导卫星细胞和成肌细胞的增殖，进而促进肌肉再生。使用 GCSF 治疗会增加mdx小鼠的肌细胞，且在mdx小鼠模型中长期的肌肉再生、功能维持甚至延长寿命中均至关重要[61]。有研究评估了GCSF对DMD患者肌肉力量的影响及安全性，发现GCSF皮下给药12个月改善了患者的肌肉力量并增加6MWT，显著降低了每个治疗周期后的肌肉肌酸激酶，且没有明显的不良反应[62]。GCSF类似物Filgastrim的Ⅰ期临床试验已经完成，但具体研究成果尚未公布。有研究认为，GSCF可降低DMD患者的转氨酶活性以及胆固醇、葡萄糖水平，这对于DMD患者和代谢综合征患者可能具有一定的意义[63]。

4.4 肌肉保护剂 由于神经元型一氧化氮合酶减少而发生肌肉缺血，导致氧化应激增加、线粒体功能受损和肌肉损伤[3]。使用磷酸二酯酶抑制剂可增加肌肉的血流量，在DMD中有一定的治疗潜力。动物实验显示，磷酸二酯酶-5 (PDE-5)抑制剂他达拉非可增加mdx小鼠肌肉力量[64]，而他达拉非在 DMD 患者中的临床试验(NCT01865084、NCT01070511)均因疗效不佳被提前终止。

二甲双胍可激活人体骨骼肌中的一氧化氮合成酶，L-精氨酸是神经元一氧化氮合成酶的底物，一项为期16周的开放实验研究证实，可通过二甲双胍和L-精氨酸组合治疗，改善DMD 中线粒体能量代谢[65]。一氧化氮途径的药理学刺激可能引起线粒体功能的改善和临床上DMD患者疾病进展的减缓。临床试验表明，对DMD患者补充二甲双胍或L-瓜氨酸也可通过一氧化氮途径改善患者的肌肉损伤[66]。

肌酸是另一种改善线粒体功能的方法。一项为期4个月的肌酸-水合物疗程显示握力改善和肌肉质量增加[67]。但另一项临床试验(6个月)结果显示，一水合肌酸治疗未能改善患者的肌力[68]。

4.5 抗纤维化药物 反复变性和再生可导致 DMD 患者肌肉纤维化。转化生长因子β(Transforming growth factor beta,TGF-β)通过阻断卫星细胞的活化刺激纤维化形成，在DMD患者中的水平升高。氯沙坦是一种血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂，能减少 TGF-β在鼠 DMD 模型中的表达[69]。结缔组织生长因子(CTGF)的单克隆抗体 FG-3019治疗 2 个月后，在 mdx 小鼠中可观察到纤维化和骨骼损伤较少[70]。FG-3019 的Ⅱ期试验正在进行中。其他抗纤维化药物，如靶向 microRNA 和 HT-100(卤夫酮)正在研究中，但卤夫酮试验由于严重不良事件而暂停。目前其他药物正在研究中，如利美泊利(钠/质子 1 型交换抑制剂，NCT 02710591)。

5 总结

鉴于DMD病理生理学的潜在复杂性，本文综述了不同疾病过程的多种干预措施。新的治疗方法旨在针对潜在的基因突变以及并发症的治疗，以减缓疾病进展。多种新兴疗法迫切需要进一步的人体试验数据，以便为 DMD 提供更明确的治疗选择。