小胶质信号通路参与神经病理性疼痛及针刺干预研究

朱怡霖，沈醉，何俏颖，方剑乔，邵晓梅

(浙江中医药大学附属第三医院/浙江省针灸神经病学重点实验室，杭州 310053)

2016年，国际疼痛研究学会(International Association for the Study of Pain， IASP)将疼痛定义为一种与组织损伤或潜在组织损伤相关的感觉、情感、认知和社会维度的痛苦体验。其中，神经病理性疼痛是慢性疼痛的主要类型，其发病率高、机制复杂，引起人们的广泛关注。据国际疼痛学研究协会的神经病理性疼痛学组(Neuropathic Pain Special Interest Group， NeuPSIG)的调查研究显示，神经病理性疼痛的患病率约为3.3%～8.2%。2013年《中国神经病理性疼痛诊疗专家共识》表明中国目前约有 9000万名神经病理性疼痛患者。神经病理性疼痛严重影响患者的工作和生活质量，容易诱发焦虑、抑郁等精神疾病，是常见的难治性疼痛疾病。

尽管近年来对于神经病理性疼痛的研究取得了一些进展，但它的发病机制尚不明确，诊断和治疗仍旧是一个巨大的挑战。目前多认为中枢神经系统中神经-免疫相互作用是引起神经系统病理变化的基本原因之一。免疫细胞可利用与神经元的共享递质来促进其与神经元间的相互作用[1]。小胶质细胞具有多样性及可塑性的特点，为中枢神经系统内固有的免疫效应细胞，在中枢神经系统的生理过程中发挥着极其重要的作用[2]。并且随着研究进展，人们开始意识到小胶质细胞参与疼痛的产生和级联放大反应，与外周神经损伤或炎症诱发的神经病理性疼痛密切相关[3]。研究显示，在中枢神经系统中，各种炎性反应和细胞凋亡构成系列级联病理变化，引起痛觉敏化。而在此过程中，小胶质细胞内的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[4]、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)[5]、Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)[6]、磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)[7]等多个级联反应可被激活，发挥神经保护和毒性损伤双重作用，对神经病理性疼痛的产生和维持至关重要。与此相关的是，研究发现调节小胶质细胞内 MAPK[8]、AMPK[9]、JAK/STAT[10]、PI3K/Akt[11]等信号通路，可使其向促炎表型M1或抗炎表型M2两种不同的极化状态转化，在神经炎症过程中发挥作用。

针刺不良反应少且疗效显著，是临床上治疗慢性痛常用的中医特色疗法之一。随着医学的发展，其机理也进一步得到揭示。目前发现，针刺通过抑制小胶质细胞的活化，可减少多种疼痛相关受体、促炎介质和致痛物质的表达，降低神经元的敏感性，在神经病理性疼痛中发挥镇痛作用[12-13]。在此过程中，针刺对小胶质细胞中MAPK、PI3K/Akt、JAK/STAT、AMPK等多条信号通路干预机制已有部分研究报道，但仍旧缺少系统性研究。本文旨在前人研究的基础上，系统阐述小胶质细胞内信号级联反应如何激活、调控基因表达，试提出小胶质细胞内级联反应介导的针刺镇痛可能机制，这将有助于理解神经病理性疼痛的病理机制，并为针刺干预神经病理性疼痛机制研究提供启示。

1 针刺通过多条小胶质信号通路发挥镇痛作用

1.1 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)

外界输入的刺激激活小胶质细胞后，小胶质细胞通过多条信号通路参与疼痛敏化过程。MAPK就是其中一条重要的信号通路。其在神经病理性疼痛发展和维持中具有重要作用。研究显示MAPK可在小胶质细胞中广泛激活并引起外周和中枢敏化[10]。而针对这一条信号通路的镇痛机制研究表明，针刺可以通过抑制小胶质细胞MAPK通路的激活，减少多种细胞因子释放和降低疼痛相关受体的表达来起到镇痛作用。

目前小胶质细胞 MAPK通路激活大致可分两条途径，钙离子依赖型和非钙离子依赖型。小胶质细胞表面可表达 P2X4[14]、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)[15]等配体门控离子通道偶联受体和趋化因子受体 2(CCR2)[3]、CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)[16]等G蛋白偶联受体。当小胶质细胞受到刺激时，这些钙离子依赖型受体即被激活，从而引起 Ga2+的内流，激活 MAPK家族的p38MAPK和细胞外调节蛋白激酶(ERK)；而IL-6、TNF-α以及一些外源性物质等促炎介质则可与小胶质细胞表面非离子依赖型受体结合，进一步激活p38和ERK[3]。p38和ERK活化之后，激活环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、核因子 kappaB(NF-κB)或其他转录因子调节基因转录过程，又反过来提高Toll样受体4(TLR4)[3]、P2X4R[14]和 CX3CR1[16]等膜表面受体的表达，同时增加多种炎症因子释放，最终引起痛觉敏化[10]。

针刺可以通过抑制 MAPK通路抑制小胶质细胞活化。梁宜等[17]实验发现，脊神经结扎(spinal nerve ligation， SNL)大鼠受损脊髓背角内p-p38 MAPK、小胶质细胞特异性标志物(OX-42)阳性细胞显著增多，而电针后p-p38MAPK、OX-42阳性细胞表达明显减少，小胶质细胞活化受到抑制。Lin L等[18]研究显示，针刺可通过抑制小胶质细胞ERK激活来发挥显著的镇痛作用。与此相似，有实验显示，针刺可通过抑制p38和ERK磷酸化，抑制超氧阴离子的合成，从而降低多种炎症介质的水平，防止痛觉敏化[19]。此外，p38和 ERK磷酸化介导了吗啡诱导的镇痛的耐受性的发展，使用电针抑制其磷酸化缓解或延缓了吗啡耐受性[20]。

除上所述，MAPK家族的第三个成员c-Jun N端激酶(JNK)也参与神经病理性疼痛的病理过程。目前发现，它主要在星形胶质细胞中表达[21]，抑制 JNK可抑制星形胶质细胞活性，减轻神经病理性疼痛[22]。但也有研究表明，小胶质细胞内 JNK与神经炎症密切相关[23]，JNK抑制剂具有神经保护和抗炎功能[24-25]。实验显示，抑制慢性坐骨神经结扎损伤(CCI)大鼠脊髓小胶质细胞内的c-JNK表达可减轻CCI引起的神经病理性疼痛[26]。然而目前关于小胶质细胞c-JNK的研究多集中在药物方面，少有关于JNK介导的针刺镇痛研究，此方面值得进一步研究。

1.2 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)

目前多将小胶质细胞的激活类型分为两种，M1型(“经典”激活的促炎表型)和M2型(“替代”激活的抗炎表型)[27]。M1型小胶质细胞产生 IL-6、IL-1β、IL-18等促炎因子，通常与炎症和神经毒性相关，而M2型分泌IL-10、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)等抗炎因子，产生神经保护作用[28]。PI3K/Akt信号通路则可介导小胶质细胞向这两种不同的极化状态转化[10]。

研究已经发现 PI3K/Akt对神经病理性疼痛具有双重调节作用。实验表明，PI3K/Akt信号通路从多个层面参与病理性疼痛的调制，在中枢神经系统中，PI3K可调节中枢神经系统的突触可塑性，调节伤害性信息，并介导由有毒刺激引起的中枢敏化[10]。此信号通路可被多种细胞因子、生长因子以及脂多糖(LPS)等物质激活。配体与受体结合后激活PI3K，随后引起Akt的活化。Akt具有多种下游效应物质，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)就是其中重要一种，抑制 PI3K/Akt/mTOR信号通路可减少小胶质细胞的活化[7]。此外，小胶质细胞在纤连蛋白刺激下可激活PI3K/Akt信号通路，并上调P2X4R蛋白和mRNA表达[14]，该受体在唤起和维持神经病理性疼痛中起关键作用[29]。抑制PI3K/Akt通路减少LPS导致的小胶质细胞活化、TLR4的表达以及细胞因子的产生可用于治疗神经炎症相关疾病[30]。这些结果揭示了小胶质细胞内 PI3K/Akt级联反应在促进神经病理性疼痛中发挥重要作用。与此相对，有实验证明PI3K/Akt通路也参与促进小胶质细胞向“抗炎”的M2极化状态转化，增加IL-10的释放[11]。同时研究发现神经受损之后小胶质细胞表达的IL-10可通过PI3K/Akt通路对皮层神经元发挥保护作用[31]。

针刺则可能通过作用于小胶质细胞内 PI3K的多个上游、旁路物质或下游效应物质，调节PI3K/Akt通路活性，发挥镇痛效应。研究表明，γ-干扰素(IFN-γ)也可促使小胶质细胞向M1表型极化[32]，而电针则可减轻CCI模型大鼠痛觉超敏并降低由IFN-γ诱导的小胶质细胞P2X4R的表达[13]。另外有实验显示，针刺可改善脑缺血后小胶质细胞 TLR4/NF-κB引起的炎症反应和神经功能损伤[33]。虽然药理学上已证明通过抑制小胶质细胞TLR4/PI3K/Akt/NF-κB信号通路可发挥抗炎作用[34]，但针刺是否能通过PI3K/Akt途径抑制TLR4的表达尚未有直接证据。另一方面，Zhao J等[35]实验提示，脊髓损伤后经电针治疗不仅可以抑制 M1巨噬细胞比例及 TNF-α、IL-1β、IL-6表达，还能增加 M2巨噬细胞的比例及IL-10和神经营养因子3(NT-3)的表达。其中NT-3为PI3K的上游物质之一[36]。同时，Tu W等[37]实验表明，电针可上调NT-3表达以调节CCI模型大鼠脊髓小胶质细胞活性发挥镇痛效应。但在针刺镇痛过程中，其是否经由NT-3/PI3K/Akt起作用，以及针刺是否通过PI3K/Akt通路诱导小胶质细胞向M2状态转化仍需要进一步研究。

由此，笔者提出一种假说，这种小胶质细胞内通路激活效应的差异可能取决于不同的信号输入，而针刺作为一种信号输入，可以通过PI3K/Akt通路诱导小胶质细胞向 M2状态转化。总而言之，小胶质细胞内PI3K/Akt信号通路介导的针刺镇痛机制有待进一步研究。扩大PI3K/Akt的研究病种，丰富针刺研究内容具有重要意义。

1.3 Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)

与PI3K/Akt一样，JAK/STAT同时具有促炎和抗炎双重作用。这种矛盾的结果或许至少部分与该途径的双重激活性质相关。实验证明，炎症因子IL-6、IFN-γ，抗伤害感受性因子IL-10均可诱导小胶质JAK/TAT级联的激活，产生促炎或抗炎效应[38-39]。

研究发现，IL-6作为小胶质细胞JAK/STAT3通路的主要激活物质之一[39]，可引起小胶质细胞活化，促进多种炎症因子的表达，并且抑制该途径能有效地阻止小胶质细胞向M1状态转变[10]。此外，在神经病理性疼痛过程中，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)也可诱导小胶质细胞JAK2/STAT3信号转导[40]。活化的小胶质细胞又可释放TNF-α、IL-6、MCP-1等炎症介质，其中MCP-1还可作用于神经元 NMDAR，启动和维持神经病理性疼痛[41]。同时研究发现，IL-10与IL-6一样，也是STAT3调节因子[28]。在小胶质细胞中，IL-10可通过诱导STAT3的磷酸化，提高细胞的存活率，发挥神经元保护作用[42]。这一过程涉及复杂的生理反应，其中抗伤害作用或与小胶质细胞向终止炎症的M2状态极化相关[38]。因此，小胶质细胞在不同损伤阶段向不同表型极化或许可由JAK/STAT这两种活化形式介导。

针刺则可能通过调节 JAK/STAT通路的上下游物质，调控小胶质细胞的极化状态，在神经病理性疼痛的病理过程中发挥良性调节作用。首先，现有研究表明，电针可通过调节脊髓组织中JAK/STAT信号通路，发挥镇痛效应[43]。其次实验显示，电针可抑制神经损伤后产生的IL-6，提高神经损伤模型大鼠的痛阈[44-45]。此外，在神经病理性疼痛中，电针可以抑制星形胶质细胞MCP-1的表达来缓解疼痛[46]，但针刺是否能够下调MCP-1表达抑制小胶质细胞JAK/STAT活化，发挥抗炎镇痛作用，仍不清楚。另一方面，实验显示，在坐骨神经分支选择性损伤(SNI)大鼠模型中，电针可以增加IL-10的产生以缓解疼痛[47]。赵泽金等[48]研究也表明电针治疗可增加SCI患者体内IL-10的含量，从而缓解神经病理性疼痛。以上实验表明针刺或许通过抑制IL-6的表达、促进IL-10的产生，经由JAK/STAT通路诱导小胶质向M2表型极化，发挥镇痛效应。

如上所述，IL-6和IL-10均可激活JAK/STAT级联反应。这两种激活形式可能引起小胶质细胞内不同的基因转录，从而改变小胶质细胞的极化状态，使小胶质细胞发挥神经损伤或抗伤害作用。且研究发现针刺可对此过程的某些炎症介质产生调节作用。然而，在神经病理性疼痛中，小胶质细胞内JAK/STAT通路是否介导针刺镇痛效应，针刺是否通过改变小胶质细胞的极化状态，抑制中枢敏化，仍需要进一步研究。

1.4 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)

近年来能量稳态对神经炎症抑制的作用引起了广泛关注。相关研究认为，维持能量平衡并参与炎症反应的信号通路可被分成促炎通路和抗炎通路[49]。AMPK就是其中一条以抗炎为主的重要通路。AMPK是一种异源三聚体的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞内 AMP：ATP比值升高后可被激活，是调节能量平衡和代谢应激的能量传感器[50]。研究表明AMPK可显著抑制多种动物模型体内的炎症[51]，其可能在神经炎症和中枢神经系统疾病的发病机制中发挥核心作用。

过去对于 AMPK在神经病理性疼痛的作用多集中在神经元的兴奋性机制方面，少有关于AMPK对神经病理性疼痛中小胶质细胞功能的调节的报道。目前已有研究证明，小胶质细胞AMPK信号通路激活可抑制神经病理性疼痛[52]。在神经病理性疼痛过程中，小胶质细胞中 AMPK激活后可诱导小胶质细胞向M2表型极化[51]，并抑制多种促炎介质的表达[5]。且实验显示，在使用AMPK激动剂白藜芦醇后，可以抑制小胶质细胞活化，并通过AMPK活化减轻神经胶质细胞介导的神经炎症，进一步抑制中枢致敏作用，从而起到持续的镇痛作用[52]。此外，AMPK 还能通过抑制 NF-κB[53]、MAPK[52]和JAK-STAT[54]等炎症信号通路和炎症基因的表达，减少炎症反应，抑制伤害性感受器的兴奋性和敏化。

另一方面针刺对神经病理性疼痛也具有显著作用。但是针刺镇痛效应是否与激活小胶质细胞 AMPK通路有关，相关研究却是少之又少。AMPK与针刺作为疼痛研究的热点，明确两者之间的关系十分重要。总而言之，小胶质细胞内AMPK是一个重要的疼痛治疗靶点，寻找到确切的激活方式对神经病理性疼痛的治疗具有重大意义。而针刺可通过多途径抑制中枢神经系统内小胶质细胞活化，改善炎症反应和神经功能损伤，但其中机制极其复杂，目前尚缺少针刺与AMPK之间的研究。因此不论是小胶质细胞内 AMPK通路在神经病理性疼痛病理过程中发挥的作用，还是其介导的针刺镇痛理论机制，都值得进一步研究。

2 展望

神经病理性疼痛已经成为沉重的临床负担，目前尚未发现治疗该疾病的特效药物，其患者广受疼痛的折磨。近 10年研究已经明确小胶质细胞内 MAPK、PI3K/AKT、JAK/STAT、AMPK等多条信号通路在神经病理性疼痛过程中发挥重要作用。同时实验已经证明针刺对神经病理性疼痛的治疗作用与其能够抑制小胶质细胞的激活密切相关。但是近年来的研究多局限在药物对这些小胶质细胞内信号通路的影响。而针刺镇痛机制研究却鲜有从上述角度切入。因此有必要对此方面深入研究，明确双方的关系，这为针刺治疗神经病理性疼痛提供理论和实验依据，促进针刺治疗在临床上的推广应用具有重要意义。