蛋白酶体抑制剂硼替佐米对食管鳞状细胞癌生长的影响

牛霞 张晓娟 毕炀辉 张玲

食管癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤第三位和第四位［1］。与西方国家不同，我国食管癌组织学类型以食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）为主。目前，ESCC治疗主要以手术结合放化疗为主，但疗效均不理想，5年生存率仅10%左右［2］。随着分子靶向药物在多种实体肿瘤成功应用，ESCC的分子靶向治疗也成为研究的热点，但目前已知的治疗靶点非常有限。

近年来，随着新一代测序技术不断发展，包括ESCC在内的癌症基因组学研究取得了较大进展［3-7］。本课题组前期应用全基因组测序及外显子组测序分别对14例及90例太行山ESCC高发区的ESCC患者癌组织及其配对癌旁正常组织进行研究，在全基因组水平筛选了食管癌相关的单核苷酸变异（single nucleotide variation，SNV）、小片段插入/缺失（insertion anddeletion，InDels）、拷贝数变异（copy number variation，CNV）及结构变异（structure variation，SV）等遗传变异，鉴定出可能赋予癌细胞选择性生长优势的显著突变基因及拷贝数变异受累基因，如 TP53、PIK3CA、NOTCH1、CDKN2A、ZNF750、FBXW7［3］。这些基因的变异可能是ESCC发生发展中的驱动事件，也可能是精准有效的分子治疗靶点。蛋白酶体抑制剂已被应用于多发性骨髓瘤、急性髓系白血病和结直肠癌等多种肿瘤中，但对ESCC的作用尚未见报道［8］。本研究进一步利用DGIdb公共药物-基因相互作用数据库，对前期及其他课题组已经发表的基因组学测序数据进行分析［3-7］，筛选ESCC相关候选药物靶基因，并进行信号通路富集分析，发现靶向蛋白酶体可能是ESCC治疗的潜在靶点，因此进一步在体内及体外探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米对ESCC细胞生长的影响，以期为蛋白酶体抑制剂应用于ESCC靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

ESCC 细胞株 KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1、KYSE510和 Eca-109购自美国ATCC公司，由山西医科大学转化医学研究中心保存。20只BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，雌性，4周龄，体重14～16 g，于无特殊病原体动物饲养室饲养，动物实验经山西医科大学伦理委员会批准（批准号：2017LL037）。RMPI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清购自Hyclone公司，四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜购自美国Sigma公司，硼替佐米（bortezomib，26S蛋白酶体抑制剂）购自Selleck Chemicals公司，Ki-67鼠抗人单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。光学显微镜为Olympus产品，自动酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2 数据分析

基因组测序数据源自5个独立队列总共469例ESCC患者，具体信息见参考文献［3-7］。利用DGIdb数据库（http：//dgidb.genome.wustl.edu）对 469例 ESCC患者基于SNV及InDels的基因组测序数据进行药物靶基因分析。

1.3 信号通路富集数据分析

采 用 Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery（DAVID）v.6.7软件在KGEE数据库中对所有药物靶基因进行信号通路富集分析。

1.4 细胞培养

ESCC细胞株 KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1、KYSE510和 Eca-109均用含10%胎牛血清的RMPI 1640培养基培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，根据细胞状态更换培养液，细胞长至80%～90%融合度时传代。本课题组前期以Eca-109细胞系进行裸鼠移植瘤实验，证实裸鼠皮下成瘤能力较强，因此选取该细胞株用于后续的裸鼠体外移植瘤实验。

1.5 MTT法检测细胞增殖情况

KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1、KYSE510 细胞以3 000/孔接种于96孔板，每孔培养液的最终体积为200 μL。培养24 h后，弃原培养液，以DMSO作用为对照组。分别加入含有100 nmol/L硼替佐米的培养液继续培养，48 h、72 h后每孔加入20 μL的MTT；4 h后吸去培养液，每孔加入200 μL DMSO，摇床孵育15 min，然后采用酶标仪检测每孔的OD值。

1.6 裸鼠体外移植瘤实验

取对数生长期Eca-109细胞，计数，注射细胞至裸鼠背部皮下，形成皮丘，密切观察。12 d后待肿瘤直径达5 mm后，将裸鼠随机分2组，每组10只。硼替佐米组腹腔注射硼替佐米1.5 mg/kg，对照组仅注射 200 μL生理盐水，3～4 d注射1次，共6次。继续培养18 d，每2～3 d记录存活小鼠数量，测量裸鼠体重及移植瘤的长径（L）和短径（W），计算肿瘤体积（V），公式V＝πLW2/6。皮下细胞注射30 d（腹腔注射18 d）后以颈椎脱臼方式处死裸鼠，解剖、分离、测量肿瘤体积并称重。

1.7 免疫组织化学法检测Ki-67蛋白的表达

所有裸鼠肿瘤组织经10%中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，连续切片后，脱蜡、烘片，抗原修复，封闭，孵育一抗Ki-67，4℃过夜；PBST洗脱3次，室温孵育二抗1 h，PBST洗脱4次，DAB显色，苏木素复染细胞核，梯度酒精和二甲苯脱水，中性树脂封片，显微镜下观察结果，并用Aperio数字病理扫描系统扫描切片，图像分析软件（Aperio Image Scope）分析Ki-67蛋白的表达情况。显微镜下以细胞核染成黄色或棕色为阳性细胞，在肿瘤细胞增殖活跃区连续计数10个以上高倍镜视野约1 000个细胞，计算阳性细胞百分率，即Ki-67增殖指数。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，则作进一步的两两比较，方差齐时采用LSD-t法，方差不齐时采用Dunnett T3法；计量资料的两组比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基于ESCC基因组测序数据的药物靶基因分析

469例ESCC的基因组测序数据在DGIdb数据库中共鉴定出307个药物靶基因，突变频率＞1.5%的药物靶基因见图1。在突变频率＞5.0%的50个基因中，只有5个基因存在药物-基因互作，均为ESCC相关显著突变基因，分别为NOTCH1（突变频率15.1%）、LRP1B（突变频率 10.0%）、PIK3CA（突变频率 9.2%）、CDKN2A（突变频率 6.4%）、NOTCH3（突变频率 5.3%）。196个突变基因突变频率在2.5%～5.0%之间，其中5个基因存在药物-基因互作，包括PTCH1（突变频率4.3%）、ERBB4（突变频率 3.2%）、ABCB1（突变频率3.0%）、NOTCH2（突变频率 2.8%）、BRCA（突变频率2.0%），前3个为ESCC相关显著突变基因。

图1 ESCC中突变频率＞1.5%的药物靶基因Fig.1 Druggable genes with mutation frequency greater than 1.5%in ESCC

2.2 药物靶基因的信号通路富集分析

通过DAVID软件对所有药物靶基因进行KEGG信号通路的富集分析，结果鉴定出以下ESCC相关信号 通 路 ：RTK-RAS、PI3K/AKT/mTOR、NOTCH、ERBB信号通路，以及细胞周期及蛋白酶体途径等，见图2。同时，发现蛋白酶体基因集在8%的ESCC病例中表现出明显调节异常，且有27种编码蛋白酶体的基因具有靶向治疗药物，包括PSMA3、PSMC2、PSMD12和PSMD8等。

图2 ESCC中药物靶基因相关的信号通路富集Fig.2 Druggable genes enriched signaling pathways in ESCC

2.3 硼替佐米对ESCC细胞增殖的影响

MTT法检测结果显示，100 nmol/L硼替佐米处理48 h 后，KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1、KYSE510细胞对照组及硼替佐米组OD值分别为（0.611±0.035 vs 0.267 ±0.045）、（1.010 ±0.073 vs 0.532 ±0.049）、（0.714±0.046 vs 0.520±0.049）、（0.571±0.028 vs 0.213±0.011）、（0.878±0.041 vs 0.209±0.023），除 KYSE150 细胞外，其余4株细胞硼替佐米组OD值与相应的对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图3A；作用72 h 后，KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1、KYSE510细胞的对照组及硼替佐米组OD值分别为（0.924±0.064 vs 0.167±0.036）、（1.319±0.052 vs 0.273±0.010）、（1.035±0.015 vs 0.503±0.022）、（0.839±0.038 vs 0.117±0.013）、（1.173±0.029 vs 0.168±0.015），5 株细胞硼替佐米组OD值亦均低于相应对照组（P<0.05），见图3B。

2.4 硼替佐米对裸鼠移植瘤生长的影响

皮下肿瘤细胞接种第12天注射处形成直径5 mm的肿瘤，成瘤率为100%。至实验结束两组裸鼠均未见死亡，存活率为100%。皮下注射肿瘤细胞30 d后处死裸鼠，剥离皮下肿瘤，测量肿瘤体积并称重，结果显示，硼替佐米组肿瘤体积低于对照组［（1 065.83±283.94）mm3vs（1 909.18±533.40）mm3，P=0.007）］，肿瘤重量亦低于对照组［（0.98±0.30）g vs（1.60±0.36）g，P=0.009］，见图 4、图 5。

2.5 硼替佐米对裸鼠移植瘤组织中Ki-67表达的影响

免疫组织化学法检测结果显示，硼替佐米治疗组裸鼠移植瘤组织中Ki-67表达量为43.83±3.22，对照组为86.32±4.51，两组比较差异有统计学意义（P=0.001），见图6。

图3 硼替佐米对不同ESCC细胞增殖的影响Fig.3 Effect of bortezomib on proliferation of different ESCC cells

图4 硼替佐米对裸鼠移植瘤体积的影响Fig.4 Effect of bortezomib on the volume of xenografts in nude mices

图5 硼替佐米对裸鼠移植瘤重量的影响Fig.5 Effect of bortezomib on the weight of xenografts in nude mices

3 讨论

癌症的发生和发展常伴随着异常基因的改变，其可导致体细胞不受控制地进行性生长。尽管大多数基因突变不会给癌细胞提供选择性生长的有利条件，但如果单个细胞发生一系列足够的驱动基因突变，即可获得极大的恶性表型。因此，靶向癌症-驱动突变基因及其相关信号通路，对延缓肿瘤进展和转移尤为重要。新一代基因组测序研究提高了对癌症分子特征的理解。本课题组前期利用全基因组测序技术鉴定了一批与ESCC相关的突变基因和信号通路［3］，但潜在药物靶点与这些基因改变的关系尚未阐明。本次研究进一步通过DGIdb数据库筛选ESCC相关的药物靶基因，在筛选出的307个药物靶基因中，只有PIK3CA和ERBB4是公认的癌基因，其突变模式以激活突变为主；NOTCH1、CDKN2A、PTCH1 和 BRCA2基因为公认的肿瘤抑制基因，显示为重复性的失活突变［3-7］。同时采用DAVID软件对药物靶基因进行KEGG信号通路富集分析，发现ESCC中存在显著改变的信号通路，包括PI3K/AKT/mTOR、RTK-RAS、ERBB、NOTCH 信号通路及细胞周期、蛋白酶体途径等。其中蛋白酶体途径是新发现的ESCC相关信号通路。

图6 硼替佐米对裸鼠移植瘤组织Ki-67表达的影响Fig.6 Effect of bortezomib on the Ki-67 expression of xenografts tissue in nude mices

人体细胞内存在两种主要的蛋白质降解途径，即自噬溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径，其中细胞内80%～90%的蛋白质经过泛素-蛋白酶体途径降解［9］。泛素-蛋白酶体途径参与DNA修复、细胞周期调节、药物耐药性、细胞增殖和凋亡、抗原呈递等［10-12］，多种转录因子、细胞周期调控因子、突变蛋白等亦可发生多聚泛素化，然后经蛋白酶体降解［9］。当一些错误折叠的蛋白、突变蛋白或癌蛋白发生降解异常时，就可能导致疾病包括癌症发生［13-14］。YADAV等［15］报道泛素-蛋白酶体途径异常与肿瘤发生、发展及预后关系密切［16］。26S蛋白酶体是泛素-蛋白酶体的组成部分，是ATP依赖的多功能蛋白水解复合物［11，17］。硼替佐米是一种双肽基硼酸盐类似物［18］，属于缓慢可逆的蛋白酶体抑制剂，通过与26S蛋白酶体的催化位点结合［10］，可抑制蛋白酶体功能，阻断蛋白降解，发挥抑制肿瘤细胞增殖、转移，诱导细胞凋亡作用［19-20］，亦是第一个被应用于临床的蛋白酶体抑制剂。SEKI等［21］研究发现蛋白酶体抑制剂硼替佐米可抑制人ESCC细胞增殖，并促进细胞凋亡。本研究采用蛋白酶体抑制剂硼替佐米在体外作用KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1和KYSE510等5株ESCC细胞，MTT检测发现硼替佐米在体外可明显抑制ESCC细胞的增殖能力；裸鼠移植瘤实验结果亦发现硼替佐米可以抑制裸鼠肿瘤生长，提示蛋白酶体抑制剂可作为ESCC潜在的治疗药物，为ESCC的靶向治疗提供新的思路。

本研究发现蛋白酶体途径在ESCC中显著改变，蛋白酶体抑制剂硼替佐米在体内和体外均可抑制ESCC细胞生长，可能作为ESCC潜在的新的靶向治疗药物，但其在ESCC细胞系中的具体作用机制以及确切的临床治疗效果仍需进一步研究。