糜蛋白酶C基因在胰腺疾病中的研究进展

汪 洋，严茂林，陈和平

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610072；2电子科技大学医学院，四川 成都 610051)

胰腺为腹膜后脏器，是人体重要的消化器官，分为内分泌腺和外分泌腺两部分，糜蛋白酶C(CTRC)主要涉及外分泌功能。胰腺疾病包括胰腺炎症和胰腺肿瘤等，胰腺炎症大体分为急性胰腺炎(AP)和慢性胰腺炎(CP)，急性复发性胰腺炎(RAP)可以转变为慢性胰腺炎，由慢性胰腺炎到胰腺上皮内瘤(PanIN)变最后到胰腺癌(PC)是一个渐变过程。CTRC基因是新近发现的CP易感基因，其突变可增加CP患病风险，会加重RAP发展到CP的病程[1]。此外，更好地了解病因因素与易感SNP的相互作用将有助于在早期阶段诊断和治疗该疾病。目前迫切需要利用基因组学上的进步，即GWAS和/或外显子组测序在NGS平台上解开尚未确定的胰腺炎易感性位点。CTRC基因突变可能导致PC的发生[2]，目前尚需更多的来自不同地区的实验来探讨PC中存在的CTRC基因突变；CTRC在PC低表达，并与PC侵袭转移有关，了解CTRC在胰腺癌前病变与癌症之间表达差异可以进一步预测该蛋白能否作为诊断标记物。本文对胰腺疾病中CTRC基因变异的研究进展做一综述。

1 CTRC结构、功能及基因定位

CTRC由252个氨基酸组成，包含5对二硫键和丝氨酸/组氨酸及天冬氨酸组成的催化中心。其编码基因(OMIM*601405)位于染色体1p36.21上，包含8个外显子，长度8.2 kb。人类CTRC基因位于ELA2A和ELA2B基因附近，CTRC和ELA2A之间的序列同源程度高于CTRC和CTRB1或CTRB2之间的序列同源程度。

CTRC基因编码胰凝乳蛋白酶C，一种消化酶。它是由胰腺腺泡细胞产生，导管细胞分泌的蛋白酶原，与酶原颗粒一起包装，并与胰腺中的其他消化酶一起分泌。CTRC在十二指肠被胰蛋白酶激活。活化后的CTRC具有很多生理功能：①促进胰蛋白酶原的自动激活：CTRC切割胰蛋白酶原的第18位苯丙氨酸和19位门冬氨酸结合处的肽键以及N端的三肽，从而清除胰蛋白酶原及其活化肽之间的静电作用，进一步促进胰蛋白酶原的自动激活。②促进胰蛋白酶/酶原的降解：通过切割胰蛋白酶原钙结合环内的第81位亮氨酸和82位谷氨酸之间的肽键，来促进胰蛋白酶/酶原的降解。两者降解的差异主要在CTRC能更快地切割阳离子胰蛋白酶原的Leu81-Glu82肽键，在阳离子胰蛋白酶原的Leu81-Glu82键断裂后，CTRC进一步以缓慢速率消化Leu41-Asn42肽键。CTRC在高位肠道促进酶原的激活，在低位肠道促进酶原的降解。肠内高钙环境会封闭钙结合环内的切割位点，使得胰蛋白酶原的降解作用是弱的，胰腺分泌的钙浓度是极微量的(以亚豪克为单位)，故CTRC占优势的功能是降解，保护胰腺内胰蛋白酶原不能提前激活。③辅助活化羧肽酶A1和A2：CTRC通过使前肽的α-螺旋连接片段蛋白水解而发挥作用，前肽解离并完全降解，使羧肽酶具有完全的活性。CTRC在多个位点切割前肽中的连接区段，但多保守在Leu96-Leu97肽键。

2 CTRC基因与AP

关于AP中CTRC基因的研究方向，目前主要在研究基因突变和基因多态性两方面。RAP的发生可能与CTRC基因突变相关，尤其是在RAP向发展CP的过程。Werlin等分析67例ARP患者发现其中有三分之一患有遗传性胰腺炎的突变，包括罕见突变(K23R)，强调了RAP患者可能主要通过遗传学导致疾病的发生[3]。对于CTRC基因多态性的研究多为关于SNP位点c.180C> T的分析，Koziel 等收集分析99例波兰凯尔采地区AP样本CTRC多态性c.180C> T与AP发病及临床过程的相关性，发现杂合c.180C> T位点改变会增加AP发生的风险[4]，后分析221例AP患者发现病例组与对照组的CTRC突变(p.I259 V，p.V235I，p.K247R254del，p.E225 A)频率没有显著差异[5]。LaRusch等也发现此常见CTRC基因位点变异c.180 C > T可作为促进RAP进展至CP的疾病调节剂，尤其合并CFTR基因变异，SPINK1基因变异，酗酒或吸烟患者可加重病程[1]。另有研究发现，伴有CTRC基因突变的脂蛋白酶缺乏的AP患者，其疾病复发的风险会增加[6]。

在儿童特发性ARP和CP，遗传分析对于确定胰腺炎的病因有一定临床价值[7]。Giefer等对342儿童急性胰腺炎患者研究发现，胰腺炎的发病年龄早与 CTRC突变密切相关，发病年龄较晚的儿童更可能由于非遗传性危险因素而致病[8]。目前主要发现CTRC位点c.180C> T的变异与AP相关，尚需进一步研究其他CTRC位点改变是否与AP相关联，尤其对于遗传学有极大影响的儿童队列而言。

3 CTRC基因与CP

CP是多种因素导致的胰腺进行性不可逆炎性疾病，其病理特征包括腺泡细胞萎缩坏死，间质纤维化及钙化。临床特征包括慢性腹痛，腹泻，呕吐，消化不良和糖尿病[9]。既往研究表明，疾病的发生与遗传学因素有关[10]。危险性遗传因素与保护性遗传因素之间的平衡决定了CP易感性。过早活化的胰蛋白酶被CTRC通过作用于无钙的钙结合环内的分子而被破坏，因此CTRC可做胰腺炎发病机制中的关键候选基因。Paliwal等对621例特发性或遗传性CP和614名德国对照者的CTRC基因全部8个外显子(8.2 kb)进行测序，确定大部分变异在第2，第3和第7外显子。后对280例CP患者外显子2，3和7测序，发现了许多错义和缺失突变。在胰腺炎组中两种最常见基因改变是c.760C> T(p.R254W)和c.738761del24(p.K247R254del)，两者均位于外显子7。此外，该研究组还研究了71例印度热带胰腺炎患者，提示该人群CTRC基因改变的频率较高，与德国队列相比，在印度队列中最常见的两种基因改变为c.217 g> A(p.A73T)错义改变和c.190193del ATTG(p.I64LfsX69)移码缺失。有研究表明与印度CP显著相关的变异位点为p.A73T和c.180C> T[11]。上述研究均表明CTRC基因突变谱在欧美与亚洲国家有差异，另有研究表明在亚洲不同国家之间其突变谱与致病性也不一致。Sun-Mi Cho等在116例韩国CP队列中发现突变p.P249L，虽然这一突变在先前欧洲研究中是致病性的，但在此特发性胰腺炎队列中不起作用[12]。Masamune等[13]在日本CP患者中发现了5种新的错义突变(8/506)。然而，只有三种变异，包括p.R29Q，p.S239C和p.R254W，在功能上被证明是有害的[14，15]。我国对于CTRC基因突变研究较少，仅台湾地区分析报道了126例成人CP患者中CTRC基因突变频繁的实验数据，包括c.673 g>A等在内的10个先前未发现的位点改变[16]。除此之外，有两项关于儿童CP的研究，一项中国儿科ICP患者的队列研究没有发现任何CTRC的致病突变[17]；另一项上海的研究在儿童CP中仅发现一例突变[18]。

CTRC基因突变导致的功能效应是CP可能的发病机制，这些功能效应主要包括四个方面：①分泌受损：Derikx等报道转染突变p.G61R的HEK 293 T细胞中CTRC的分泌是不可测量的[19]。在用重组腺病毒转染的AR42 J大鼠腺泡细胞系中观察到由p.A73T突变引起的分泌缺陷[20]。移植突变p.I64LfsX69和p.G103 VfsX31以及无义突变p.W55X也预期会导致CTRC分泌的完全丧失，但缺乏直接的实验证明；②催化活性下降：Chee等研究发现具有p.K247R254del和p.G217 S突变的CTRC无催化活性，而具有p.Q48R和p.A73T突变的CTRC酶活性降低[21]；③被胰蛋白酶降解：突变体p.G217R，p.G217 S和p.K247R254del在低胰蛋白酶/CTRC比率条件下几乎完全降解[14]；④增加内质网应激的倾向：CTRC突变可诱导蛋白的错误折叠，引起ER应激，激活炎症转录因子核因子κB(NF-κB)，随后腺泡细胞死亡，进而导致CP。ER应激相关的CTRC突变通过SIRT2介导的微管失调减少胰腺酶原分泌[22]。

4 CTRC基因与胰腺上皮内瘤变

胰腺上皮内瘤变(PanIN)是一种显微镜下的扁平或乳头状非侵袭性病变，主要发生在直径小于10 mm的小胰管，内衬一定程度异性的柱状或立方细胞。根据结构和细胞核异性程度可以将PanIN分为PanIN-1，PanIN-2和PanIN-3三个等级，其中PanIN-1可以进一步分为PanIN-1A和PanIN-1B。PanIN是胰腺导管腺癌(PDAC)最常见的前体病变，可经过多个阶段的组织学和遗传学改变进展至PDAC。在遗传学方面，PanIN和PDAC存在多种相同的分子改变，包括K-ras基因激活突变，Smad4表达缺失，c-erbB-2基因过表达等。Buchholz等研究基因表达谱发现，基因表达的最大变化发生在PanIN分期1B和2之间，表明PanIN-2可能代表PDAC进展中的第一个真正的肿瘤前期阶段[23]。此研究还发现与正常胰腺组织相比，CTRC基因在PanIN表达显著增高，尤其在PanIN-2，此外PanIN与胰腺导管腺癌相比，CTRC基因表达亦有显著差异，提示CTRC可能标记PanIN的重要性。目前尚缺乏胰腺癌前病变与CTRC基因相关性的研究，需要更多的实验探讨两者之间可能的联系，同时进一步证实当前的发现。

5 CTRC基因与胰腺癌

胰腺癌恶性程度极高，预后差，5年生存率不足7%[24]。在美国消化道肿瘤相关死亡率中排第四名。据美国癌症协会统计数据表明，仅9%的患者在肿瘤早期或局限期被诊断胰腺癌，5年生存率约为25%，而约53%的患者在确诊时已处于肿瘤晚期，5年生存率仅2%[25]。CTRC基因突变可能导致胰腺癌的发生。有研究表明，伴有CTRC基因突变的慢性胰腺炎患者，患胰腺癌的风险将增加。波兰一项纳入16例胰腺癌患者的研究CTRC多态性p.G60 =(c.180C>T)在胰腺癌患者中频繁出现[2]。目前发现CTRC基因多态性c.180C>T改变广泛存在CP及PC中，是否提示伴有此多态性位点改变的患者会影响CP向PC进展。与上述研究不同的是，对德国121例PC患者研究发现CTRC基因突变似乎不显著增加胰腺癌的风险[26]。在CTRC基因拷贝数变异上肉瘤改变最为显著，其次未淋巴瘤，而胰腺癌无统计学差异，说明PC中CTRC基因改变主要在于基因突变和基因多态性改变，而非基因拷贝数变异。考虑到CTRC在PanIN与PC中的差异表达，是否可以在癌症早期阶段通过检测组织或分泌到血液中CTRC的表达来达到早诊断。早治疗的目的。目前尚需要进一步实验探讨在胰腺癌与癌前病变之间CTRC基因改变与表达的差异，并明确血液中CTRC在两种疾病间的表达差异趋势是否与组织上一致。

综上所述，CTRC基因改变在多种胰腺疾病中被发现，并参与胰腺疾病的进展过程。随着遗传学的发展，人们对于胰腺疾病与CTRC基因的相关性理解得到了很大的提高。应建立理想的动物模型，找到关键的发病机制，并将其应用于临床，为急慢性胰腺炎的治疗提供新的思路。同时后续需要大量深入研究来探讨CTRC基因突变在胰腺癌中的功能效应，以及CTRC与胰腺癌相关表型的相关性，为PC的诊断和防治提供新的策略。