诱发矽肺动物模型方法及评价

张丹参 金姗

河北科技大学，石家庄，050018，中国

矽肺是在生产过程中长期吸入较高浓度的粉尘引起的以肺部纤维化为主的职业性疾病［1］。其潜伏期较长且发病机制复杂，即使脱离粉尘环境病情仍可进展，目前尚无有效治疗矽肺的药物和方法，严重危害着劳动者的身心健康［2］。粉尘的种类很多，常见生产性尘有游离二氧化硅（矽尘）、石棉尘、煤尘、炭黑尘、滑石尘、水泥尘、云母尘等，有的作业环境中的粉尘为混合性粉尘。接触不同种类的粉尘可引起不同的尘肺。我国法定职业病名单中规定了十二种尘肺，即矽肺、煤工尘肺、石墨尘肺、炭黑尘肺、石棉肺、滑石尘肺、水泥尘肺、云母尘肺、陶工尘肺、铝尘肺、电焊工尘肺和铸工尘肺。各种矽肺的病理和临床特征各异，但其基本的病理改变均为粉尘引起的以肺胶原纤维化为主的病变［1］。在探索矽肺发病机制、研发相关治疗药物时往往需要开展动物实验，因此，成功建立矽肺动物模型至关重要。本文通过对矽肺动物模型的相对全面的介绍，特别是对相关模型的评价，希望能为研究矽肺纤维化的形成机制提供参考，为矽肺治疗的临床研究提供基础理论。

1 动物的选择

矽肺实验动物模型一般采用体积较大的小型猪、羊、犬；体型较小的家兔、大鼠、小鼠等。大鼠和家兔的暴露法实验操作相对简单，建立的模型已相对成熟。

1.1 家兔

兔肺与人肺形态学上的不同在于：兔的胸膜相对较薄而且小叶间隔发育不良，甚至可能缺如［3］。家兔具有个体较大，寿命较长，各种临床和病理改变易于观察。与其他大型动物相比，在购买、饲养及造模成功率上，兔占优势。研究显示，与其他小型动物相比，兔肺高分辨率CT 扫描可行，高分辨率CT，可清楚显示病变［4］。

1.2 小鼠、大鼠

小鼠具有体型小，便于大批量饲养管理，生活周期短，取材便利等特点，是相对理想的矽肺实验性动物。但是由于小鼠生理条件的限制，非暴露式方法难于实现。国内外目前已趋向于使用鼠的开放式模型，为减少因手术感染而诱发细胞因子调控复杂性，手术过程应该在无菌条件下完成［5］。大鼠体型相对较大，实验操作相对简单，大鼠的暴露法建立的模型已相对成熟。

1.3 小型猪

小型猪体型较大、生活周期长、容易饲养、来源较易、耐受性强易于操作，并且小型猪肺的顺应性好，生理特性更接近人类，是生物医学研究中最理想的实验动物之一，常使用3～5 月龄、体质量为5～20 kg 的幼猪［6］。小型猪可以反复、多次进行肺部灌洗；小型猪肺部体积远远大于大鼠和家兔，利于肺部X 射线观察，更利于影像学和病理结果的对照，这些指标的观察和人体更为相似。

1.4 犬

用小鼠、大鼠、家兔等动物复制矽肺动物模型，但因其个体较小，不利于临床研究的开展。以犬为矽肺大动物模型相比鼠、兔等小动物，更有利于矽肺病临床实验研究的开展，特别是需要呼吸机辅助通气的肺灌洗治疗［7］。

2 矽肺动物模型建立方法与评价

目前，常见的建立尘肺病动物模型的方法有气管注入染尘法、吸入染尘法、肺外染尘法等。

2.1 气管注入染尘法致矽肺模型

气管注入染尘法主要包括非暴露式气管内注入法、暴露式气管内注入法、穿刺式气管注射染尘法。这种方法操作简便，染尘剂量易控制，染尘后动物死亡率低，是目前最常用的矽肺模型复制方法；其缺点是动物接触粉尘的方式，与工人在作业环境中接触粉尘的实际情况相差较远。

2.1.1 非暴露式气管注入染尘法致矽肺模型

动物经乙醚麻醉后，用线或纱布套住门牙，挂在染尘架上，呈仰卧位，抬高近头部染尘架位置，使之保持45°～60°倾斜；术者用无齿解剖镊子轻轻拉出舌头，再用左手拉住；用右手将耳镜插入口腔，借助灯光，见到随呼吸时开时闭的气管开口时，左手松开拉住的舌头，用左手固定好耳镜，右手持钝头穿刺针，从气管开口处轻轻插入；助手将已吸好粉尘悬液的注射器连接在穿刺针上，回抽时有连续气泡上升，确认插入气管后，将粉尘悬液注入气管内［1］。

用非暴露式气管内注入法建立尘肺病动物模型，操作时间短，对动物的损伤较小。重要的是对麻醉剂量的掌握，如果麻醉过度，很容易导致动物死亡。

2.1.1.1 大鼠非暴露式气管注入染尘法致矽肺模型乔俊华等［8］使用将满浸乙醚的纱布块置于带盖塑料桶内，将大鼠置于塑料桶内进行乙醚麻醉（约10～15 s），待大鼠完全麻醉后取出，左手食指及中指固定大鼠颈部（勿太用力，以免引起大鼠窒息），使大鼠头冲向术者，尾部远离术者方向，身体呈仰卧位，用镊子将大鼠舌头拉出，置于口腔一侧，将小喇叭小口尽量置于口腔深部，前段尽量上翘，左手拇指及无名指固定小喇叭大口边缘，调整额镜，使光源反射至小喇叭底部，观察大鼠声门，可见声门随大鼠呼吸开合，右手执气管插管，经由声门插至主气道（注意动作要轻柔、准确、迅速），可在插管外端听见大鼠呼吸音，表示气管插管成功，将预吸好的煤尘悬液1 mL 迅速经气管插管注入，拔出气管插管，竖立大鼠，保持大鼠直立体位，左右来回旋转并按摩双肺10 次，使煤尘进入肺内并均匀分布。邹昌淇，Kato K，Lassance R M［9-14］等人也采用了此方法建立了矽肺鼠模型。

2.1.1.2 家兔非暴露式气管注入染尘法致矽肺模型 顾志娟，吴逸明等人［15-16］将饲养观察2 周的兔放在固定笼中，耳缘静脉注入3%戊巴比妥钠溶液，用量1 mL·kg-1每只。注射完毕，至家兔四肢肌肉松弛，角膜反射消失，即表明进入麻醉状态。将兔平放在手术台上，仰卧，固定上、下肢及门齿。术者左手握住兔颈项，食指轻压喉结部，以使声带易于暴露，右手持新生儿喉镜从口腔插入，尽量向上拉直颈项，以使喉镜镜片向上压，暴露声门，便于看清声带，看清声带后，将穿入引入导丝的塑料气管导管经口从声门处插入，插入导管过程中动物出现轻度呛咳，即可判定为导管进入气管，拔出（引入）导丝，以线状棉絮浮于导管口，观察气流，以确定导管在气管内（如果动物剧烈躁动，适当追加戊巴比妥钠0.2～0.5 mL·kg-1的剂量）。导管从口腔插入至气管内约14 cm 左右。导管进入气管后，在导管末端迅速接上含有定量浓度（100 mg·mL-1）粉尘的注射器，注入悬液，迅速拔出导管和喉镜，按摩双肺，以保证粉尘自然进入左、右支气管。约1 h 左右，动物逐渐苏醒。为预防感染，每只家兔注射青霉素20 万U·d-1，连续3 d。

2.1.1.3 小型猪非暴露式气管注入染尘法致矽肺模型蒲新明等［17］将猪麻醉后，平放在手术台上，仰卧，三脚架手术中单联合固定，必要时绷带辅助固定。然后取适量长度绷带辅助轻拉开猪吻，咽喉镜轻挑舌根和喉部，开放喉头，行气管双腔支气管导管插管（必要时纤支镜引导插管），纤支镜检查是否进入气管内，选择气管、支气管部位，然后套囊充气固定。双腔支气管导管插管后，氯化琥珀胆碱静脉注射停止自主呼吸，封闭气管、左肺支气管套囊。左肺SiO2粉尘混悬液经纤支镜引导下灌注，剂量150 mg·kg-1。灌注液内添加青霉素200 000 U·d-1防止感染。左肺灌注10～15 min 后，封闭右肺支气管套囊，右肺灌注等量灭菌生理氯化钠，方法剂量同左肺。每周1 次，共5 次。

2.1.1.4 犬非暴露式气管注入染尘法致矽肺模型 李永强等［7］将实验犬以饲料喂养，染尘或肺灌洗前空腹过夜，染尘前以速眠新注射液按0.1 mL·kg-1肌肉注射，待实验犬麻醉后送实验室，在实验台上以仰卧位固定四肢。在喉镜直视下经口插入单腔气管插管，填充插管气囊并固定插管位置后，接呼吸机控制通气，按实验分组称取已高压灭菌的二氧化硅粉末经气管插管以少量多次的方式，利用呼吸机通气将二氧化硅粉末吹入实验犬肺内，每次染尘时间持续约1 h，术后实验犬归圈饲养。

2.1.2 暴露式气管注入染尘法致矽肺模型

穿刺式气管注射染尘法操作过程简单、快速，适用于大鼠、兔等较大动物的矽肺模型复制操作过程。常选用大鼠（170～240 g）或家兔来复制矽肺模型。取一定量含游离SiO299%以上的DQ-12 型石英粉，经酸化处理后，先取尘粒在5 mm 以下的那一段混悬液，烤干后准确称取需用量，加0.9%氯化钠制成混悬液（灭菌），大鼠用50 mg·mL-1气管内注入1 mL，家兔用120 mg·mL-1气管内注入1 mL·kg-1，可复制矽肺模型。

这种方法的优点是能够非常直观地观察过程，并将粉尘混悬液准确地注入气管，对非暴露式染尘法无把握者可采用暴露式气管注入染尘法。但该方法操作比较复杂，需进行微创手术，稍有不慎容易造成出血。此外，手术所造成的创口增加了动物肺部感染的机会［20］。有报道［18］，小鼠皮肤切开分离暴露气管，环甲膜穿刺，将粉尘注入气管，其24 h 内动物死亡率达15%。

2.1.2.1 小鼠暴露式气管注入染尘法致矽肺模型 向军俭等［5］选取雌性健康小鼠，每只动物腹腔注射戊巴比妥钠2 mg 麻醉。取仰卧位固定于染尘架上，75%酒精消毒小鼠颈部皮肤，眼科剪沿中线剪开约1.2 cm 长切口，暴露气管。吸取二氧化硅悬液经软骨间隙注射到气管内。肌肉及其他组织复位，缝合皮肤。

Bissonnette E 等［18］通过腹 膜内注 射（0.02 mL）6.5∶1 氯胺酮（100 mg·mL-1）和甲苯噻嗪的混合物轻度麻醉小鼠，并且通过解剖暴露气管。将无菌盐水溶液中的毒性颗粒吸入具有25 号针头的胰岛素注射器中，并在滴注前将它们快速重悬。将含有0.5 mg 石棉纤维或5 mg 二氧化硅颗粒的0.025 mL 推注物以45 度角直接施用于气管（动物抬头），并用尼龙线（Ethilon 4-0）缝合覆盖的皮肤。动物接受0.025 mL 剂量的盐水溶液滴注，轻轻按摩动物的胸部以促进分布。

2.1.2.2 猴暴露式气管注入染尘法致矽肺模型 尹汝泉等［19］报道，猴体质量6.4～10.4 kg，在2%硫喷妥钠静脉麻醉下，通过间接喉镜暴露声门，用14 号小儿气管导管插入气管内约5～8 cm，然后分别向两侧肺内缓缓注入灭菌的石英粉尘生理盐水悬液，同时立即转动体位，使尘液尽可能分散到各肺叶。体质量7 kg 以上的猴染尘4.5 g，7 kg 以下者4.0 g，分两次染尘，间隔20天。染尘时粉尘悬液中加入青、链霉素。染后，再肌注青、链霉素三天，预防肺部感染。

2.1.3 穿刺式气管注射染尘法致矽肺模型

穿刺式气管内注入染尘法是将粉尘混悬液直接穿刺注入气管内，适用于大鼠、兔等较大动物的矽肺模型复制。

穿刺式气管内注入染尘法操作过程简单、快速，与暴露式气管内注入染尘法比较，简化了复制家兔尘肺模型的操作过程，减少了动物的损伤及肺部感染的机会，缩短了机体恢复时间，提高了实验质量，弥补了较大动物（如家兔）不易行非暴露式气管内注入染尘的不足，是一种简便快速、易掌握、便于推广的染尘方法［22］。

2.1.3.1 兔穿刺式气管注射染尘法致矽肺模型 兔经耳静脉注入地西泮2.5 mg·kg-1、盐酸氯胺酮25 mg·kg-1麻醉，固定于动物架上，充分暴露颈部，局部剪毛、消毒后，于甲状软骨下1 cm 处插入穿刺针头。将吸有灭菌注射盐水的注射器连接于套管尾端，轻轻抽吸，见有连续气泡产生，无阻力、无负压时，确认已插入气管后，将针芯拔出，套管继续轻轻向下插入至气管分叉处（套管前端有阻挡感）时，将套管后退约2 mm。将吸有粉尘悬液的注射器连接于套管尾端，急速一次注入。然后，再注一定量空气，拔出套管［1］。

2.1.3.2 大鼠穿刺式气管注射染尘法致矽肺模型 王莹［21］等人将石英粉尘（分散度≤5 μm 的二氧化硅颗粒占97.9%）按100 mg·mL-1浓度配成悬浊液备用。麻醉雄性Wistar 大鼠后，在喉结处用接导管的采血针刺入气管内，将吸有少量生理盐水的注射器接导管另一端，回抽，有气泡且无阻力，说明采血针刺入气管内。将吸有生理盐水的注射器拔下，换接吸有1 mL 石英粉尘混悬液的注射器，将混悬液推入气管内，并向气管内注入一定量的空气，保证混悬液全部进入气管内，并以利于混悬液顺利进入肺内［22］。

2.2 吸入染尘法致矽肺模型

气管内注入染尘法虽能在短期内建立尘肺病模型，但从矽肺病的发病机理而言，并不符合矽肺病的自然或实际发生过程，且其实验操作技术要求较高，同时会对动物造成损伤或引起并发症等，因此它们并非最理想的尘肺病动物模型［23-24］。吸入染尘法可以弥补气管内注入染尘法的缺陷，能真实地模拟人体通过呼吸道吸入粉尘过程，而不会对动物造成任何不必要的损伤。

2.2.1 动式经口鼻吸入染尘法致矽肺模型

动式经口鼻吸入染尘系统由粉尘发生器、空气压缩机等部分组成，主要适用于动物对于外源物的动态吸入式染尘实验。粉尘发生器能将干燥粉末样品连续稳定地生成气溶胶，通过计算机控制精密滑台实现精准送样，旋转电刷推送样品至剪切口，通过狭缝的高速气流粉末样品剪切分散，形成粉尘气溶胶［25］。

用动式染尘控制系统可以建立起较为理想的矽肺模型，其优点在于该动式染尘系统可设定一定的粉尘浓度，且由动物自行吸入，属无创性动物模型，且操作简单。但该设备属大型仪器，价格较高，仅适合于高校或大型研究所或企业研究用。

王晔等［26］采用HOPE-MED 8050 动式染尘控制系统建立大鼠矽肺模型：选取健康的40 只雄性大鼠，适应性喂养一周后，随机分对照组、1 d、3 d、7 d、2 周、4 周、8 周、12 周组，共8 组，每组5 只。按相应的时间进行动式染尘，将动物成笼放入染毒室内染尘，每次放入3 组动物，每只动物每天染尘2 h；至相应时段处死大鼠，对照组不染尘，正常喂养12 周后处死。高学敏［27］等人也采用了此方法建立Wistar 大鼠矽肺模型。

2.2.2 静式经口鼻吸入染尘法致矽肺模型

实验动物放置于粉尘平均浓度216 mg·m-3的发尘箱内，其中浮游于空气中的粉尘粒子91% 以上小于5 微米。每日染尘3 h，60 d 后解剖观察［28］。Manar Gamal Helal［29］等人在轻度硫喷妥钠的麻醉下在大鼠鼻内安装二氧化硅结晶颗粒，诱导矽肺病。

将动物整体置于粉尘环境中，操作起来比较方便。动物较长时间自然吸入由发尘器发出的含矽尘空气后，可形成肺内典型的矽结节和纤维化病变。此法的优点是动物接触粉尘的方式与工人在作业环境中接触粉尘的实际情况近似。缺点是染尘装置的耗资较大，从染尘开始到形成形矽肺病变的时问较长，染尘剂量难以控制，染尘过程中动物感染和死亡率较高，用本法染尘者较少。

2.3 肺外染尘法

2.3.1 皮下注入染尘法

将定量石英粉尘生理盐水悬液注入动物肋部皮下，间隔一定时间后观察注射部位的病变形态及纤维化程度。

2.3.2 腹腔注入染尘法

将定量石英粉尘生理盐水悬液注入腹腔，染尘后间隔一定时间观察网膜纤维化程度。

2.3.3 静脉注入染尘法

经静脉注入一定量的粉尘悬液后，间隔一定时间，观察肝内纤维化程度。

肺外染尘法操作简单，所形成的纤维化病变易于观察，但由于此法与工人在作业环境中接触粉尘的实际情况不同，故采用此法染尘者很少［1］。

3 矽肺动物模型注意事项

3.1 气管注入染尘法注意事项

麻醉深度应适宜，麻醉过浅，可因动物挣扎而致误伤，反之，可使粉尘悬液在肺内分布不均匀；如注入粉尘悬液后动物窒息，可立即进行人工呼吸，多数在l min 内可恢复［1］。在气管插管过程中，有时因大鼠的个体差异，气管位置深浅和大小不一，或者大鼠分泌唾液太多影响视野，可以调整大鼠的角度或用套管针在大鼠喉部轻轻拨动分泌物，直到看到气管口，行气管插管［30］。暴露式气管注入染尘法，手术过程应该在无菌条件下完成，以免感染。为防止肺部感染，染尘器械和粉尘悬液应严格消毒。穿刺针头必须与气管保持在同一直线上，插入深度以气管上中段为宜，过深会造成粉尘悬液在肺内分布不均匀或引起动物死亡。穿刺式气管注射染尘法应注意针头插入后，必须经检验确认插入气管无误时，方可注入粉尘悬液。注入粉尘悬液后，应随即使动物保持头高脚低的体位数分钟，以防粉尘悬液倒流［1］。

3.2 吸入染尘法注意事项

3.2.1 尘粒大小的选择

粉尘的分散度与其在呼吸道中的阻留有关。粒径在1～2 μm 左右的粉尘，可较长时间的悬浮在空气中，被机体吸入机会也更大，危害性相对大。粒径小于15 μm 的粉尘颗粒称为可吸入性粉尘，直径小于5 μm 的粉尘颗粒称为呼吸性粉尘，多可达呼吸道深部和肺泡区。所用粉尘需经充分研磨，使粉尘的粒径＜5 μm 占95%以上，使其能具有较强的致病性［8］。

3.2.2 粉尘暴露浓度及量的选择

给予大鼠气管内一次性滴注1 mL 浓度为50 g·L-1的可吸入性煤尘悬液，可以得到满意的矽肺动物模型，同时该剂量不至于导致动物过高的死亡率。

总之，动物模型已经成为一个强大的科学研究工具，模式生物也逐渐增加。动物实验对于探索疾病的发病机制、研发相关药物、临床治疗等均有极其重要的意义。通过矽肺动物实验，可以深入的了解到矽肺的发病机制。目前已经建立了许多实验方法学，如何使方法学标准化，建立更方便更有效的矽肺动物实验模型是今后需要探索的方向。