非酒精性脂肪性肝病相关肝细胞癌发病机制研究进展

朱光曦 综述，文良志，陈东风 审校

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指以肝细胞内异常脂质沉积为主要病理特征的临床综合征，不伴有过度饮酒史。其疾病谱包括从单纯性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、非酒精性脂肪性肝炎相关肝纤维化（non-alcoholic steatohepatitis-liver fibrosis，NASH-LF）及非酒精性脂肪性肝炎相关肝硬化（non-alcoholic steatohepatitis-liver cirrhosis，NASH-LC），最终可发展成肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1]。有研究报道全世界约有25%的成人患有 NAFLD，南美洲以31%居于第一，亚洲人群患病率也高达27%，高于世界平均水平[2]。而肝细胞癌的发病率位居世界第五位，其病死率更高居世界第二位。有研究报道80%的肝癌病例发生在发展中国家，特别是东亚和亚撒哈拉地区，这些地区的慢性乙肝和丙肝的流行与其高肝癌发生率息息相关[3]。但近些年来，由于人们生活水平改善及生活习惯改变引起的肥胖、糖尿病和代谢综合征非常普遍，NAFLD引起的HCC正逐年上升。在美国SEER登记处统计的2004-2009年间4929例HCC病例中，有14.1%的HCC是由NAFLD引起的，并且在这6年间NAFLD-HCC患者数量保持着9%的年增长率[4]。美国的另一项调查显示，NAFLD的肝移植候补名单注册人数从2004年的804人增加至2013年的2174人，使其迅速成为美国肝移植的第二大疾病[5]。目前由NAFLD引发的健康问题引起了社会和医学界的广泛关注，改变不良的生活方式、减少诱因在控制NAFLD-HCC发生中起着不容小觑的作用。

1 NAFLD相关肝癌的发病机制

NAFLD和HCC有许多共同的病理生理机制和危险因素，但目前关于NAFLD相关肝癌的具体发病机制并不明确，主要有以下几种学说。

1.1 胰岛素抵抗与NAFLD-HCC 目前，有研究报道NAFLD按其来源可分为两种类型，“代谢型”和“遗传型”。“代谢型”NAFLD 与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）相关，而“遗传型”NAFLD不一定与IR或脂毒性相关，但过量的热量摄入和体内总脂肪的增多可加重“遗传型”NAFLD进一步发展的风险。目前胰岛素抵抗被公认为是“代谢型”NAFLD的危险因素[6]。胰岛素不仅调控葡萄糖，还参与血管的动态平衡，保证器官血流灌注。已有研究报道在NAFLD动物模型上研究了胰岛素对肝微血管系统的影响以及IR对窦状内皮细胞的影响[7]。而对于胰岛素抵抗在NAFLD相关肝癌中的作用也有研究证明胰岛素抵抗和游离脂肪酸的增加能发挥协同作用增加瘦素等细胞因子的释放，降低脂联素的水平，从而促进NAFLD的进展。除此之外，与这些释放的炎症因子相关的细胞间相互作用也能加重肝脏的损伤，引起肝细胞的坏死、增殖，甚至癌变[8]。最近有研究报道，肝脏脂肪酸转位酶FAT/CD36的上调与胰岛素抵抗、高胰岛素血症显著相关，而且有助于NAFLD患者肝脏脂肪的积累，从而促进疾病发展[9]。另有研究证据表明，胰岛素敏化剂的使用，主要是甲福明二甲双胍，能降低糖尿病相关的NAFLD患者发展为HCC的风险[10]。从以上内容可知，胰岛素抵抗能联合其他多种因素导致NAFLD的发生发展，甚至发生癌变。

1.2 氧化应激与NAFLD-HCC 氧化应激（oxidative stress，OS）是由于机体受到内源性或外源性的伤害性刺激时所引起的氧化与抗氧化作用的失调。氧化应激时所产生的自由基蓄积，主要包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮，以及其诱导的DNA氧化损伤和异常蛋白表达均对机体有不良影响。氧化应激可直接通过对脂质、蛋白质和DNA分子的损伤触发炎症反应和纤维化发生，从而促进NAFLD的发展。其产生的大量ROS可以直接减少谷胱甘肽等抗氧化分子，抑制超氧化物歧化酶等抗氧化酶，从而加重机体的氧化损伤[11]。有研究报道在动物模型上，异常的脂质代谢可引起肝内CD4+T淋巴细胞的选择性丢失，从而加速肝细胞癌的发生。CD4+T淋巴细胞内含有比CD8+T淋巴细胞更多的由线粒体来源的ROS积聚，通过特异性体内阻断ROS能够逆转NAFLD诱导的肝脏CD4+T淋巴细胞减少以及阻抑HCC的发生[12]。另外在NAFLD动物模型上，氧化应激可能通过激活G2/M DNA损伤检查点，阻止细胞周期蛋白B1/CDK1复合物的活化，从而导致肝实质出现大量的病理性多倍体单核细胞，而这种病理性的多倍体化可能是促进NAFLD发展为HCC的早期事件[13]。另有一项临床研究发现肝组织中的8-OHdG含量可能是氧化应激的标志物，其在NASH-HCC的患者肝脏内含量明显高于没有HCC的NASH患者，因此8-OHdG可能会成为预测HCC的一个有用指标[14]。所以，氧化应激过程中产生的ROS对NAFLD-HCC疾病的进展具有重要作用，是NAFLD-HCC发生的重要机制。

1.3 腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）通路与NAFLD-HCC AMPK是高度保守的细胞内腺苷核苷酸水平的感受器，能够感知微量的ATP产物的减少，从而平衡ATP的产生与消耗。AMPK激活后，能通过调节细胞周期、凋亡、自噬、抑制脂肪酸从头合成和蛋白质合成等多种途径来抑制细胞增殖[15]。最近有研究报道，目前可通过抑制线粒体功能、线粒体解偶联、直接激活和AMP模拟物等药理学策略来达到激活AMPK的目的。而肝脏和脂肪组织中AMPK的激活可能通过以下三条途径来降低NAFLD的发生率，包括抑制肝脏从头合成脂肪酸、增加肝脏脂肪酸氧化和增强脂肪组织线粒体功能[16]。另外有研究报道，HCC患者的AMPK功能是失调的，其低p-AMPK染色与HCC的侵袭性临床病理特征及不良预后相关。而二甲双胍能通过激活AMPK抑制体外和体内的HCC细胞生长，还能增强顺铂诱导的HCC细胞生长抑制作用，提示二甲双胍和AMPK活化在HCC的治疗具有潜在重要价值[17]。以上研究结果提示AMPK作为许多通路的共同作用因子，其功能紊乱对NAFLD-HCC的发生发展具有重要影响。

1.4 自噬与NAFLD-HCC 自噬是指细胞在生理条件或饥饿、感染等应激损伤状态下内质网部分膜脱落形成囊泡包被自身细胞质蛋白或细胞器，再通过溶酶体降解其所包裹内容物的过程，是细胞应对损伤、平衡能量需求和更新自身细胞器的方式[18]。根据物质运送到溶酶体的途径不同，可将自噬分为三种形式，微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬，目前研究最多的主要是巨自噬。有研究报道自噬受到PKA通路和TOR通路调控，其分别可感应细胞环境中的碳和氮，且存在交互作用。在氮感应通路中，MTORC1则受到氨基酸、生长因子和缺氧的调控，而AMPK可直接或间接地抑制MTORC1[19]。在NAFLD中，肝细胞自噬反应受限，这会引起错误折叠的蛋白质聚集体在内质网中积累，导致氧化应激、DNA损伤和基因的不稳定性增强，从而促进肝癌发生[20]。一定程度的可控性自噬诱导则可以改善NAFLD的肝损伤情况[21]。自噬在肝癌的发生发展中起双重作用。一方面，自噬在正常组织中起着抑制肿瘤的作用。自噬可通过消除衰老损伤的细胞，限制染色体的不稳定性，来抑制健康细胞突变为肿瘤细胞[22]。beclin 1基因是一种肿瘤抑制基因，通过调控细胞自噬、凋亡和分化来发挥肿瘤抑制作用，其单等位基因缺失可导致细胞增殖增加和自噬活动减少，从而促进肿瘤的进展。有研究报道HCC组织的beclin 1 mRNA表达显著低于慢性肝炎和肝硬化组织[23]。另一方面，越来越多的研究证据表明，一旦肿瘤发展，自噬可通过提供营养物质来帮助肿瘤细胞的生长[24]。自噬可以通过降解受损伤的细胞器、DNA、蛋白质和病原体来提供能量，从而有助于肿瘤内部细胞在缺氧缺血环境下的存活[22]。因此，自噬根据肿瘤发展的阶段而发挥其抗肿瘤或促肿瘤作用，从而对NAFLD-HCC的发展起着双重调控作用。

1.5 肿瘤代谢、干细胞与NAFLD-HCC 在上个世纪20年代，由Warburg最早观察到肿瘤细胞能量代谢的异常状态，肿瘤细胞对糖酵解产能的依赖性增强的现象，即“Warburg效应”。近些年来，肿瘤能量代谢的重编程已经被认为是肿瘤的一个新的特征。不管是有氧还是缺氧的条件下，癌细胞都更依赖糖酵解，而不是在线粒体内进行的氧化磷酸化作用。即使糖酵解使癌细胞获得的能量比正常的三羧酸循环少了18倍，但糖酵解增加使得糖酵解的中间产物参与到核苷酸、氨基酸等各种生物大分子的合成通路中，从而加速肿瘤细胞的合成[25]。而在NAFLD-HCC中，有研究报道当健康肝脏向NAFLD转变时，就已经开始发生代谢重塑了。而在NAFLD阶段，则开始发生从线粒体呼吸到胞质糖酵解的Warburg转换和脂肪酸β-氧化的增加，并且这种代谢重塑将一直持续到HCC发生和发展阶段[26]。另有研究报道，相比与肝硬化肝癌的高水平的β-羟基丁酸，酪氨酸，苯丙氨酸和组氨酸，NAFLD-HCC表现出高水平的谷氨酰胺/谷氨酸。提示谷氨酰胺合成酶途径的活化可能是NAFLD致癌过程的一部分[27]。另有研究报道在患者标本和动物模型实验中发现，肝祖细胞在具有诱因的肝脏微环境中可能发生多能基因（c-Myc，Oct-4，KLF-4 和 Nanog）和形态发生基因（Gli-1）的活化，而这可能使肝祖细胞重新编程而变成一种具有部分多能性的肿瘤干细胞，从而成为NASH-HCC的肿瘤起源细胞，促进NASH向癌前病变及肿瘤进展[28]。

1.6 肠道菌群与NAFLD-HCC 以往被忽视的肠道菌群如今已成为大众焦点。众所周知，微生物是自然界中种类最多、数量最大的生物类群，其庞大的基因组被称为“宏基因组”，也称为“微生物环境基因组”。而肠道微生物的数量是人体细胞总数的10倍，其更拥有100倍于人类的基因总数[29]。近年来，有大量研究报道肠道菌群与NAFLD之间存在着紧密联系。其中，有研究发现NAFLD患者的肠壁通透性明显高于健康人，这种通透性增加可能跟小肠壁细胞间紧密连接的破坏有关，而NAFLD患者的小肠细菌过度生长（small intestinal bacterial overgrowth，SIBO）程度也较健康人高[30]。还有研究报道肠道菌群失调能够通过增加肝脏内源性酒精产物、TNFα产物和TLR信号通路活化以及改变胆汁酸成分来影响NAFLD的发生发展[31]。与健康人相比，NAFLD患者肠道菌群的多样性降低，其肠道菌群的成分也发生变化。有研究发现在NAFLD患者的排泄物中，毛螺菌科、布劳特氏菌属、大肠志贺氏杆菌属、肠杆菌科等肠道细菌数量增加，而普雷沃菌属、拟杆菌门、瘤胃菌科等肠道细菌数量降低[32]。这些肠道菌群成分的变化可能在NAFLD进展中起到重要作用。而关于肠道菌群在NAFLD-HCC中的作用也有相关报道，Loo TM.最近研究发现，革兰氏阳性肠道细菌成分脂磷壁酸，能够与肠道细菌的代谢产物脱氧胆酸共同作用促进HCC的发展，其主要通过促进肝星状细胞的衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）转化，从而上调环氧化酶 2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达，而 COX-2 介导的前列腺素E2具有抑制抗癌免疫的作用[33]。以上说明肠道菌群也作为NAFLD相关HCC的发生机制之一，其更具体的作用机制还有待进一步研究。

1.7 表观遗传学修饰与NAFLD-HCC 虽然HCC基因组改变能解释肿瘤发生的许多问题，但现代基因组学现况提示不能仅着眼于DNA水平的改变而忽视了表观遗传修饰的改变。最近有证据表明，营养过剩和代谢途径可通过染色质修饰因子的失调而引发表观遗传修饰，从而导致致癌过程中异常增高的转录活性。表观遗传修饰主要包括microRNA调控，DNA甲基化，组蛋白修饰和泛素化等[34]。最近有研究报道，组蛋白去乙酰化酶HDAC8能够通过抑制p53/p21介导的细胞凋亡、抑制G2-M期细胞周期停滞和刺激b-catenin信号传导而促进肝细胞增殖，并且在细胞和动物模型中均可促进胰岛素抵抗。而下调HDAC8可以抑制NAFLD-HCC的发展[35]。组蛋白H4K16的去乙酰化是人类癌症的共同表观遗传特征，有研究报道组蛋白H4K16的去乙酰化可能通过下调自噬相关基因而抑制自噬依赖性细胞死亡，也可能参与下调凋亡相关基因而抑制肝癌细胞的凋亡发生，并且这些组蛋白修饰变化从肿瘤前期开始一直存在于整个肝癌发生过程。所以H4K16去乙酰化被看作是NASH发展为HCC的一个关键病理生理机制[36]。同样地，泛素化修饰也与NAFLD-HCC有着密切的关系。Gp78是一种E3连接酶，主要通过对错误折叠的内质网蛋白进行泛素化修饰来调节内质网相关降解。而有研究报道Gp78的表达与NASH-HCC的临床肝癌分级呈负相关，Gp78可能作为NASH-HCC发生的抑制因子而发挥作用[37]。从以上研究结果来看，表观修饰的改变可以影响NAFLD-HCC的进展，也可以为NAFLD-HCC提供新的诊疗方向。但考虑到细胞内表观修饰作用网络非常复杂，还需要大量深入的研究才能阐明它们之间的关系。

2 NAFLD相关肝癌防治展望

HCC是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其病死率高居所有恶性肿瘤里的第二位。HCC最初主要被归因于慢性HBV和HCV感染人群，但现在随着肝炎疫苗的普遍应用，HBV、HCV相关肝癌正逐渐减少，而由于现阶段人们生活水平的改善以及饮食习惯的改变，肥胖、糖尿病、代谢综合征和NAFLD等逐渐上升为全球性的健康问题，与之相关的HCC的发病率也日益成为医学界关注的焦点。目前关于NAFLD-HCC的发病机制还远未阐明，其可能的发病机制包括胰岛素抵抗、氧化应激、自噬、AMPK、肠道菌群、表观修饰改变，以及肿瘤代谢和肿瘤干细胞等，但还需深入进行大量的研究和探索工作。

针对NAFLD患者，除了提倡人们恢复健康的饮食习惯和日常锻炼之外，积极开发可靠的HCC风险评估系统和预防工具，进一步探索NAFLD-HCC的发病机制，以确定有效治疗HCC的新分子靶点和特异性药物将是下一步防治工作的重点。除此之外，在今后还需要针对具有风险因素的NAFLD患者提供长期的随访和监测，以便即时早期诊断及早期治疗，进一步改善NAFLD-HCC患者的预后。