昆虫热激蛋白的研究进展

张天浩，张仙红

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

热激蛋白(Heat shock protein, Hsps)又称热休克蛋白，是细胞或生物体在一定时间内遭受高于其正常生长温度8～12 ℃(一般称为亚致死温度sub-lethal temperature)以上的温度时，新合成或含量增加的一类蛋白质[1]。近几年，大量研究表明热激蛋白不仅能被高温所诱导，还能被低温、缺氧、高盐、pH、紫外线、水分胁迫、营养饥饿等其它许多损伤因素和应急刺激所诱导，因此有时也被称为胁迫蛋白(stress proteins)[1]。

对热激蛋白的研究始于1962年，Ritossa[2]在对果蝇进行热激时发现，短暂的热激能诱导黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)唾腺组织产生一类新的蛋白质，即热激蛋白(Hsps)。此后又陆续从原核生物(细菌)、高等动物鸟类和哺乳动物的组织或培养细胞中发现了热激蛋白。1982年Adems等证实了一切生物细胞(包括原核生物和真核生物)在受到高温诱导时均可合成热激蛋白。我国对Hsps的研究始于上世纪80年代中期，研究对象以哺乳动物和高等植物为主。尽管Hsps最初在昆虫中被发现，但很长一段时间内对昆虫Hsps的报道却很有限。近年来，随着生物科学技术的快速发展，测序效率及精确率的提升，Hsps的研究取得了很大的进展。本文就昆虫Hsps的分类、生物学特性、Hsp与昆虫抗逆性及Hsps在害虫治理中的作用进行综述。

1 Hsps的分类

1.1 按照分子量进行分类

按照分子量进行分类的方式众多，孙涛等[3]将Hsps分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp20、Hsp10七个家族。而多数研究者更倾向于将分子量介于15～50 kD的Hsp分子归为一类，统称为小分子热激蛋白(sHsps)，如Carper等[4]将Hsps分为Hsps110、Hsps90、Hsps70、Hsps60、小分子Hsps和泛素等6个家族。此外，还有学者认为可以按照分子量大于80 kD，30～70 kD和小于30 kD将Hsps分为3大类[5,6]。由Morimoto等[7]提出的分类方式目前得到大多数研究者的认可，他们将Hsps分为Hsp90、Hsp70、Hsp60和小分子Hsp 4个家族，并认为许多大分子Hsps来源不同，不具有相似的生物学功能，因此不能成为一个家族。

1.2 按照诱导表达情况进行分类

按照Hsps在生物体内的存在情况及胁迫条件下的表达情况，可将Hsps分为组成型和诱导型两种。

组成型热激蛋白(Constitutive forms heat shock protein cognates, Hscs)在正常条件下即可大量表达，而对外界刺激的响应不明显，具有持家基因的功能，在生物体生命活动中起重要作用。如赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)的Hsp90蛋白与复眼发育有关[8]；家蚕(Bombyxmori)热激蛋白BmTrap1在5龄幼虫精巢中的信号值为雌性卵巢中的6倍，说明该基因可能与精巢发育与精子发生相关[9]。

诱导型Hsps在生物体内正常条件下不表达或表达量很少，但当机体处于逆境中时会大量表达，如苹果蠹蛾(Cydiapomonella)CpHsp90在高温胁迫下的表达量是正常温度下的12倍以上[10]；沙葱萤叶甲(Galerucadaurica)2龄幼虫GdHsp70在0 ℃以下低温时的表达量显著高于5 ℃时的表达量[11]。诱导型Hsps可修复损伤蛋白，并帮助蛋白质正确折叠，起分子伴侣的作用。

2 Hsp的生物学特性

2.1 Hsp90的生物学特性

Hsp90s是一种广泛存在于原核生物和真核生物细胞中含量丰富的蛋白质[12]。根据物种和细胞器的分布特征，Hsp90s可分为5大类：Hsp90A、Hsp90B、Hsp90C、TRAP和HTPG。其中Hsp90 A、Hsp90B和TRAP分别分布于细胞质、内质网和线粒体中，Hsp90C特异性分布于叶绿体中，HTPG则仅存在于真菌中[9]，且分布于不同位置的Hsp90相互之间相似性很低。

Hsp90最重要的作用之一是能够与酪氨酸激酶、丝氨酸-酪氨酸激酶、类固醇激素受体等信号传导蛋白相互作用并形成复合体，使其具有生物学活性[9]。此外，不论是否受到逆境胁迫，Hsp90在各种类型的细胞中均有存在，作为分子伴侣与变性蛋白结合，维持其正常折叠状态[13]。所以，即使是在无胁迫条件下，Hsp90对真核生物必不可少[14]。

Hsp90s在进化上高度保守，具有5条特征序列：YSNKEIFLRE、LGTIAKSGT、TGQFGVGFYSAYLVAD、IKLYVRRVFI、GVVDSEDLPLNISR[15]。其N-端均含有保守的ATPase结构域，是ATP/ADP结合位点[9]；C-末端通常会发生二聚化，以二聚体的形式存在[1]。不同昆虫之间相应的Hsp90相似性较高。如苹果蠹蛾(C.pomonella)CpHsp90与亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、绿豹蛱蝶(Argynnispaphia)、二化螟(Chilosuppressalis)、斜纹夜蛾(Spodopteralitura)等的氨基酸序列一致性均高达96%[10]。

2.2 Hsp70的生物学特性

Hsp70s是一类存在于原核细胞与真核细胞中功能重要、含量丰富的细胞保护蛋白。按照诱导表达情况，Hsp70s分为组成型(Hsc)和诱导型(Hsp)2类。组成型Hsc在未受到胁迫的细胞中就可表达，而Hsp则由应激诱导产生。在受到环境因子诱导时，Hsp70s普遍上调表达，且比Hsp90s上调更加强烈，有时上调幅度能够达到正常状态下的几百倍，小胸鳖甲(Microderapunctipennis)5龄幼虫Hsp70在热激条件下甚至能够达到对照组的5 290.7倍[8]。

Hsp70s的主要作用为帮助蛋白正确折叠、水解不稳定蛋白、引导蛋白的跨膜运输、协助蛋白定位等，还可调控诸如转录因子类的调控蛋白的生物学功能[15,16]。

Hsp70s具有3条特征序列：IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSVL、VVLVGGSTRIPKIQQ[17]。所有Hsp70均含有1个高度保守的44 kD ATPase功能域，能够特异结合ATP；1个较为保守的15 kD多肽结合功能域；1个靠近C-端的10 kD不保守可变区和C-末端基序。由于其保守区域占总序列的比例较大，致使Hsp70s成为Hsps超家族中最为保守的一类，即使分类地位属不同门下，其相应Hsp70有时也具有较高的同源性。沙葱萤叶甲(Galerucadaurica)热激蛋白GdHsp70的3D结构与牛的相应蛋白同源性可达72.5%，氨基酸序列与马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)LdHsp70的一致性达到了89.1%[11]；莲草直胸跳甲(Agasicleshygrophila)AhHsp70核苷酸序列与马铃薯叶甲(L.decemlineata)的相似性达到79%，氨基酸序列相似性达到94%[18]。

2.3 Hsp60的生物学特性

Hsp60s是一类主要存在于线粒体中的核编码蛋白质，负责保护机体免受不良环境条件的影响和蛋白质的再折叠[3]，参与核基因编码的蛋白质进入线粒体后的折叠与组装，还参与线粒体本身编码蛋白质的折叠与组装[1]。

Hsp60s的特征序列为：AAVEEGIVPGGG[17]，具有ATP结合位点，C-末端含有(GGM)n序列[12]。在线粒体基质内，7个Hsp60亚基构成一个环状寡居结构[19,20]，这样2个环状结构叠加在一起形成桶状结构[21]。在胁迫条件下，Hsp60先与ATP结合，使其本身发生构象改变，从而能够结合蛋白进行维持和修复[12]。目前有关昆虫Hsp60 s的研究较为匮乏，可能与其抗逆能力稍差，作用时间较迟缓有关。

2.4 sHsp的生物学特性

sHsp是一个非常多样的群体，其种类繁多。不同物种体内所含sHsp的种类数往往不同，如啤酒酵母只含有1种sHsp，而高等植物所含sHsps的种类可达30余种[22]。根据它们在细胞内的不同定位以及DNA序列，又可将其分成5类：class I和class II存在于细胞质中，线粒体sHsp、内质网sHsp和叶绿体sHsp则位于细胞器中[23,24]。

sHsp在细胞内能够根据行使功能的不同形成高度有序的寡聚体(200～800 kD)，主要功能包括维持谷胱甘肽水平、细胞间活性氧化物的调节，而行使分子伴侣功能时则需要解聚。还有研究表明，异色瓢虫(Harmoniaaxyrides)体内的3种sHsps，表达量分别在4龄末期、成虫期和蛹末期达到最高，说明sHsp在生物体生长发育和分化及对抗细胞凋亡过程中也发挥着重要作用[25]。

在Hsp超家族中，sHsp的保守性相对较差，种属特异性较强[17]。但所有sHsp的C-端均含有一段约100个氨基酸残基组成的保守区域，由于与α-晶体蛋白同源性很高，故称为α-晶体结构域，是鉴定sHsps家族的重要特征[17]。不过，尽管结构相似且拥有共祖接点，二者在进化树中仍然各自聚为一大类，说明α-晶体蛋白和sHsps是平行进化的两大类基因[22]。

3 Hsp的作用特性

大量研究表明，诱导型Hsp的积累决定着真核细胞的抗逆性，且Hsp在生物体内的积累量与抗逆性呈正相关[26,27]。Hsps诱导的抗逆性与其分子伴侣(molecular chaperones)作用有关[28]。在高温或其他逆境胁迫下，蛋白质的空间构象会发生改变，尤其是处于折叠状态的蛋白质更容易受到损伤，但在分子伴侣的作用下，热敏蛋白的损害减少，从而使生物获得抗逆性。

但Hsp的作用并不是一成不变的，大量文献表明其表达具有以下特点：

3.1 Hsp作用的速效性和非长效性

热激蛋白的转录调控发生迅速，由Hsp诱导的耐热性在较短时间内就能获得，热激后1～2 min内就能检测到转录[10]。如灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)4龄幼虫热激蛋白LsHsp90在40 ℃热激下0.5 h后达到最大值，并且显著高于处理2 h时的表达水平[29]。说明若长时间热激，则昆虫体内的热激蛋白呈现先上升后下降的趋势。这一现象可能是由于热激蛋白长时间的大量表达对机体不利，故热适应后便会迅速下调[10]。

3.2 Hsp指导的耐热性具有温度上下限

在热激处理棉花粉蚧(Phenacoccussolenopsis)的试验中，3种Hsp虽然表达量有所差异，但均在43 ℃或45 ℃时达到最高[26]；沙葱萤叶甲(G.daurica)在-10 ℃处理后GdHsp70的表达量大量增加，但在-14 ℃处理后却与对照组无显著差异[11]。可能是由于极端温度超出Hsps对机体的调节范围，致使昆虫快速死亡。

3.3 预处理能够增强机体抗逆性

研究发现，在致死高温处理前如果进行温热预处理，则能够明显增加昆虫的耐热性，延长致死时间或降低死亡率[11]。申建茹等[10]在研究苹果蠹蛾(C.pomonella)热激蛋白CpHsp90时发现，将苹果蠹蛾直接热激，在40 ℃时会达到最高表达量，温度超过40 ℃之后就会呈现下降趋势；而如果热激前先进行35 ℃预处理，则CpHsp90表达量在45 ℃时达到最高。汪慧娟等[25]对异色瓢虫(H.axyrides)冷驯化过程中也得到了相似的结论。

3.4 不同种类Hsp响应不同的逆境刺激

不同种类的Hsp会对不同种类的刺激做出反应，一些种类的Hsp仅响应高温刺激，如小胸鳖甲(M.punctipennis)MpHsp70对高温响应强烈，但对低温的响应显著性不强，甚至受到抑制[8]；有些则仅对低温做出反应，如沙葱萤叶甲(G.daurica)2龄幼虫中GdHsp70在-10 ℃时响应强烈，而对高温的响应不明显[11]；也有应对高低温均能响应的Hsp，如灰飞虱(L.striatellus)LsHsp90[29]；还有一些能够对化学刺激等逆境做出反应，如果蝇(Drosophilasp.)经敌敌畏处理后，精巢中的Hsp70被显著诱导[30]。

3.5 同种Hsp在同一个体不同组织中的差异表达

Hsps在不同组织中的表达量往往差异很大。有研究表明，同种sHsp在异色瓢虫(H.axyrides)不同色型中的表达情况也不尽相同[25]。正常状态下，苹果蠹蛾(C.pomonella)中肠和脂肪体中的CpHsp90表达量显著高于表皮和淋巴，说明同一个体不同组织中Hsp含量不同。经热激处理后，表皮和淋巴中的CpHsp90显著上调，而原先表达量较高的中肠和脂肪体内的CpHsp90含量则明显下降，说明表皮可能是对热激响应最活跃的组织[10]，而中肠和脂肪体中CpHsp90含量的下降可能是由于高温抑制了表达。同时，Hsp的本底水平越低，对热激的响应程度就越高[8,10]。

3.6 Hsp功能的作用具有交互性

Hsps的合成与对其它类型的胁迫产生耐受力也有关，包括低氧、局部缺血、酸中毒、能量缺乏、低温、紫外辐射等。有试验表明，Hsp的导入可使原本对高温敏感的果蝇初生精子细胞具备耐热性[6]，这说明外界导入的Hsp同样具有提高生物体抗逆性的能力；此外，通过化学诱导产生的Hsps，同样也有提高耐热性的作用[6]，同时，高低温诱导的Hsps在功能上也具有交互作用，即预冷刺激能够提高昆虫在高温下的存活率[31,32]，这也说明同一种Hsps可诱导不同的抗逆性。

4 Hsp的研究意义

4.1 Hsps在系统发育分析中的作用

由于Hsp90s、Hsp70s、Hsp60s和sHsps具有保守性，在物种间具有特异性[11,17,18]。因此对Hsps序列的测定和分析，可以得到许多具有指导性意义的信息，如可作为遗传学特征进行分类，构建系统发育树，通过对比某些基因在物种之间的相似性来确定它们的亲缘关系。

进化树分析表明棉花粉蚧(P.solenopsis)、赤拟谷盗(T.castaneum)、家蚕(B.mori)、黑腹果蝇(D.melanogaster)大分子量Hsps与sHsps各自独立成族，Hsp70s和Hsp90s在4个种间交叉成族，说明大分子量Hsps和sHsps分别属于独立的基因家族，而Hsp70s和Hsp90s则是在物种分化之后才分别演化的，同时棉花粉蚧ep-Hsp60与ep-Hsp90均与半翅目聚为一支[3]，这为传统分类学上将同翅目与半翅目合并的提议提供了依据。家蚕(B.mori)、诗神袖蝶(Heliconiusmelpomene)、帝王蝶(Danausplexippus)、黑腹果蝇(D.melanogaster)、西方蜜蜂(Apismellifera)的Hsp90A、Hsp90B和TRAP分别聚为一支，说明这些热激蛋白在物种分化前就已经产生且保持着较低的进化速率，这可能是由于功能约束导致的[9]。诗神袖蝶和果蝇的诱导型Hsp70s各自聚为一支，而组成型Hsc70s则存在1∶1直系同源关系，这说明Hsp70s是在物种形成后发生特异性扩增产生的，而Hsc70s则在物种分化前就已经发生基因扩增[30]。

贾栋等[18]对昆虫纲5个目60种昆虫进行Hsp70s系统发育树分析，结果表明Hsp70可以把各目昆虫单独聚类，同时反应目以下昆虫之间的亲缘关系，说明Hsp70s可以作为系统进化分析的标志基因。申建茹等[10]对昆虫纲6个目61种昆虫的Hsp90s进行系统发育分析，系统发育树结果与传统分类学基本吻合，但鳞翅目下蝶类和蛾类交叉成族，没有各自聚成一支，暗示鳞翅目的传统分类方式可能存在缺陷。

4.2 Hsps在环境监测中的作用

由于生物体Hsps具有在受到逆境刺激后能够快速显著上调这一特点，使其在环境监测工作中具有重要作用[11]。传统的环境监测依赖于某些特定的环境指示昆虫，如石蛾、步甲、蜉蝣等[33]；而利用热激蛋白表达水平对环境进行监测则可不受物种的限制，任何种类的昆虫都能作为监测对象。目前已有研究表明，昆虫体内某些热激蛋白会对化学药剂产生响应，如烟粉虱地中海隐种(BemisiatabaciMediterranean)热激蛋白BtHsp70在不同浓度烯啶虫胺、毒死蜱、高效氯氰菊酯等化学药剂的刺激下均显著上调[34]；另有研究表明，一些土壤污染物可以诱发土壤昆虫某些热激蛋白的表达，通过测定土壤昆虫体内对应热激蛋白的含量即可诊断土壤的污染状况[32]。

4.3 Hsps在害虫治理中的应用

昆虫对逆境的抗性在很大程度上决定于Hsp的表达。许多种类的Hsp决定昆虫对环境逆境的耐受性，而抑制这些Hsp的表达则会对昆虫的抗逆性产生影响。通过分子手段对昆虫的个别Hsp基因进行干扰，可使昆虫因抗逆性降低而死亡。

Lv等[35]、Busby等[36]对雌性B型烟粉虱(bemisiatabacibiotype B)和肩突硬蜱(Ixodesscapularis)的Hsp23/Hsp20和Hsp70基因进行了RNA干扰，影响了其对高温胁迫的响应，降低了在高温下的存活率；而抑制红尾肉蝇(Sarcophagacrassipalpis)Hsp23或Hsp70的表达则会使其非滞育蛹的耐热性降低[37]。

此外，贾栋等[18]通过对莲草直胸跳甲(A.hygrophila)Hsp70s的研究发现，诱导最高温度(Tmax)和生物体开始大量死亡的温度相吻合，说明某些Hsps的Tmax能够很好地代表昆虫的耐受极限温度，是揭示物种耐受性的重要指标。若是将其应用于化学杀虫剂领域，通过测定某些Hsps的诱导最高浓度Cmax，就能快速确定能够大量杀死害虫的最低浓度。