乳腺癌耐药蛋白在消化道肿瘤中的作用研究

邓凤莲,黎 梨,黄赞松

邓凤莲,黎梨,黄赞松,右江民族医学院附属医院,广西肝胆疾病临床医学研究中心 广西壮族自治区百色市 533000

黄赞松,右江民族医学院研究生学院 广西壮族自治区百色市 533000

核心提要： 三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette superfamily G member 2,ABCG2)在一些肿瘤组织中高度表达,外排化疗药物,降低细胞内药物浓度,它已成为肿瘤多药耐药性的主要因素.了解ABCG2生理及表达影响因素,研究其调控机制及逆转多药耐药,为消化道肿瘤的临床基础研究提供参考.

0 引言

肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)是指肿瘤细胞接触某一种药物发生耐药的同时也对不同作用原理的其他化疗药物产生交叉耐药性[1],它已成为大多数病患化疗失败的主要原因之一.在癌症中形成多药耐药的机制尚不完全清楚,目前认为其包括：MDR1基因及其编码的P糖蛋白(P-gp)、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette superfamily G member 2,ABCG2),和其他三磷酸腺苷结合转运蛋白(ATP-binding cassette,ABC)转运体高表达,致药物外排增加[2];改变靶蛋白(如拓扑异构酶和微管蛋白)的表达或功能[3];诱导细胞产生解毒途径(如谷胱甘肽转移酶催化谷胱甘肽与药物的结合)[4];增强端粒酶活性与 DNA修复功能[5];改变凋亡信号通路(如p53突变和bcl-2家族表达异常等)等[6,7].当今,ABC转运蛋白导致肿瘤MDR机制是抗癌研究的热点.ABCG2是ATP结合盒转运蛋白家族的成员,其过表达是促进细胞中各种化合物外排的重要机制之一[8].后来,越来越多的研究表明,ABCG2可以通过从细胞中排出底物来介导MDR[9,10].已有研究表明ABCG2与消化道肿瘤[11]、乳腺癌[12]、卵巢癌[13]、白血病[14]、脑肿瘤[15]等肿瘤病患的抗药性及预后有关.本文对ABCG2生理及表达影响因素,研究其调控机制及逆转多药耐药等进行综述.

1 ABCG2简介

1.1 ABCG2的历史 Chen等[16]于在1990年使用阿霉素和P-gp抑制剂维拉帕米筛选乳腺癌MCF-7细胞系.发现一种新的分子量为Mr75000的蛋白质,当时此类细胞并无P-gp和MRP表达,这说明有另一种新的转运蛋白存在.直到1998年,Doyle等[17]使用mRNA指纹技术在乳腺癌细胞株MCF-7/Adrvp中检测到2.4 kb的基因mMRA.它编码655个氨基酸,转录后的蛋白质可以介导MDR,因其首次在乳腺癌细胞株被发现,故命名为乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP).此后,人们分别从人胎盘和耐米托蒽醌(Mitoxantrone)的人结肠癌细胞SI-M1-80克隆BCRP基因.因而BCRP又分别被称为 ABCP(P1 acenta specific ATP-binding cassettetransporter)和MXR(Mitoxantrone resistance transporter)[18].后来把BCRP、MXR、ABCP多个别称的ABC转运蛋白统称为ABCG2.

1.2 ABCG2的基因定位及结构 人ABCG2基因是4q22-23,长约66 kb,含有总共16个外显子和15个内含子[19].其mRNA为2.4 kb,编码655个氨基酸.ABCG2为ABC结合盒转运子(ABC transporters)超家族中的一员.ABCG2只有C端的6个跨膜区和N端的一个ATP结合区,为半分子转运泵,若要发挥作用,则需以二聚体或多聚体存在.此家族中的半转运蛋白常位居胞内,全转运蛋白位居胞膜,但ABCG2虽属半转运子却位居胞膜[20],这种特性可能与其生理功能密切相关.

1.3 ABCG2的生理功能 ABCG2蛋白在正常人肠道、胆道、胚盘、血脑屏障、干细胞等组织中具有功能,并可参与药物代谢等过程.它可将药物泵出细胞外,加强毒性物质排出和防止细胞吸收抗肿瘤药物,保护其免受毒性物质损害,起到维护健康细胞的功能.人类ABCG2的生理作用决定了ABCG2的这种具体分布特征[21].

1.4 ABCG2抑制剂 ABCG2既可以调节肿瘤细胞的增殖能力,又可以促进肿瘤细胞的迁移和侵袭.而有些抗癌药是ABCG2的底物,由于ABCG2的外排作用而导致其生物利用度下降,影响治疗效果.因此,抑制ABCG2的活性可提高药物生物利用度、逆转肿瘤耐药、提高疗效和改善肿瘤病患的预后.目前,已经发现多种ABCG2的抑制剂.烟曲霉素C(fumitremorgin C,FTC)是第一个被发现的ABCG2特异性抑制剂,但由于其具有较强的神经毒作用而被禁用于临床.人们后来发现多种FTC类似合成物,如Ko132、Ko134、Ko143是效果较好的ABCG2抑制剂,其中Ko143对ABCG2的抑制作用比FTC强10倍以上[22].而有学者Liu等[23]研究发现Ko143由于其酯基团而导致代谢稳定性差,该研究为开发更好代谢特性的KO143类似物具有指导意义.Wu等[24]研究发现tyrphostin RG14620是一种有效的选择性ABCG2调节剂,可用于克服耐药肿瘤患者的化疗耐药性.其他特异性抑制剂还包括新生霉素、他莫昔芬的衍生物TAG-11、TAG-139以及哌可啉的衍生物比立考达等[25].而非特异性抑制剂主要包括依克立达(GF120918)及类似物Tariquidar、姜黄素以及酪氨酸激酶抑制剂如埃罗替尼、伊马替尼、苏尼替尼等.这些抑制剂的作用机制主要分为以下4种：(1)通过抑制ATP酶活性而抑制ABCG2转运活性,如FTC和KO143[26];(2)抑制剂即为ABCG2的底物,其直接竞争性地抑制ABCG2的转运,如伊马替尼、阿帕替尼等[27];(3)有些抑制剂与ABCG2结合而改变ABCG2构象,从而影响ABCG2的转运,如沙奎那韦、利托那韦等[28];(4)通过caspase非依赖性途径,诱导凋亡细胞死亡,如NP-1250[29].但由于ABCG2有多个底物结合位点,可识别不同类型的底物,而寻找到一个能抑制多个位点、选择性强、副作用小的抑制剂非常困难,也是我们今后研究需要考量的问题.

1.5 ABCG2在肿瘤中的表达和作用 ABCG2在一些肿瘤组织中高度表达,外排化疗药物,降低细胞内药物浓度,它已成为肿瘤多药耐药性的主要因素.ABCG2高表达可提高肿瘤细胞迁移和侵袭能力[30],促进肿瘤细胞生长及转移,产生耐药,导致病情恶化;ABCG2的低表达可抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡[31],并提高化疗效果.因此,了解影响ABCG2表达的因素,同时检测ABCG2表达水平,可以针对性制定个体化治疗.

2 影响ABCG2表达的因素

ABCG2在正常和癌细胞中的表达受到不同程度的调节,包括基因扩增、表观遗传修饰、转录和转录后调控.近年来的研究表明,多种转录因子如缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、雌激素受体(estrogen receptor,ER)等可以与ABCG2启动子或增强子区的特定反应元件结合,参与ABCG2的转录调控[32].

2.1 缺氧 缺氧是一种常见的生理和病理现象,也是肿瘤微环境的重要特征之一[33].低氧诱导因子家族(hypoxia inducible factors,HIFs)是低氧效应的关键分子,包括HIF-1、HIF-2和HIF-3.HIFs-Iα(HIF-1α)是目前发现介导细胞缺氧的最关键的核转录因子.它可促进血管形成,保持细胞氧及代谢均衡,以促肿瘤成长,并导致化疗抗药性.Martin等[34]研究发现肿瘤干细胞ABCG2表达上调,后者还是HIF-2α的直接靶点,过表达HIF-2α-ABCG2信号通路诱导癌症干细胞的耐药性.体外实验表明ABCG2的功能因为HepG2细胞的低氧因素而加强,并且发现在低氧区域中ABCG2蛋白的表达增加;这表示缺氧是上调ABCG2表达的一个要素.据推测,ABCG2在缺氧环境中的过表达可能会增加细胞对肿瘤细胞中药物的耐药性[22].朱芸等[35]研究发现低氧诱导后 HIF-2α、ABCG2蛋白及ABCG2 mRNA较常氧组表达明显上调,且HIF-2α与ABCG2蛋白表达呈高度正相关.同时,卿小松等[36]也发现ABCG2和HIF-1α表达随缺氧时间的增加而逐渐增加.且ABCG2与HIF-1α的表达呈正相关.这表明ABCG2表达是HIF-1α影响缺氧时癌细胞存活及耐药性的机制之一.滕凤猛等[37]研究发现,细胞内活性氧含量随着耐药浓度的增加而逐渐减少,细胞凋亡率明显下降,检测HIF-1α、MDR1、MRP1、BCRP mRNA表达上调.目前,各种迹象表明肿瘤微环境缺氧是诱导癌细胞对抗癌药物耐药的重要因素之一.缺氧可通过HIF-1α调节癌细胞中ABCG2的表达,也可以通过抑制凋亡而出现获得性耐药.

2.2 激素 有研究表明,ABCG2的表达受激素水平的调节.张玉华等[38]发现黄体酮可通过黄体酮受体介导,并BCRP启动子上游的孕酮反应元件(PR)结合.从而激活BCRP基因的启动子而增加BCRP mRNA的转录,正性调节 BCRP蛋白的表达和功能.张澍等[39]发现当雌激素受体及G蛋白偶联雌激素受体同时被激活时,雌二醇上调ABCG2表达,抵抗疗效.但G蛋白偶联雌激素受体的特异性激活降低 ABCG2表达,并增加疗效.但目前对孕激素及雌激素调控BCRP的具体调控机制及作用效应尚不明确,深入研究ABCG2调控机制将对临床治疗提供更有用的资源.

3 DNA甲基化与肿瘤的关联

DNA甲基化是一种表观遗传修饰,可导致染色质构造、DNA三维结构、DNA稳定性和DNA与蛋白质相互作用的变化,从而控制基因表达[40].在正常健康细胞中,CpG岛处于非甲基化或低甲基化状态,并且在某些疾病影响或药物干预下可发生高甲基化.从而抑制目的基因的表达[41].研究发现,启动子区CpG岛的高甲基化或去甲基化可抵抗或增强多种药物转运蛋白的表达[42].研究表明,在多药耐药细胞系中,当ABCG2启动子低甲基化时,ABCG2高度表达.而其过甲基化时ABCG2蛋白表达下降.To等[43]研究表明CpG岛中抑制因子复合物的DNA甲基化依赖性形成有助于ABCG2的失活.Turner等[44]研究发现启动子的去甲基化增加了ABCG2表达,说明启动子甲基化可调节ABCG2在人骨髓瘤细胞中表达并具有功能,并可能有助于形成耐药性.袁建辉等[45]发现ABCG2启动子区从-359到-353位点发生高甲基化,这增加了该基因在乳腺癌中的表达.因此,这些研究表明ABCG2启动子区的甲基化与其表达负相关.因此,我们可以通过改变ABCG2基因的甲基化水平来调节其表达来逆转多药耐药性.

4 ABCG2在消化道肿瘤中的作用研究

作为ABC家族中的跨膜蛋白,ABCG2在肿瘤抗性过程中受到越来越多的关注.目前,关于ABCG2在乳腺癌、脑肿瘤、肺癌和白血病等肿瘤中的研究很多.新近研究显示,ABCG2过表达于实体瘤干细胞内,不仅能阻止肿瘤干细胞分化,还可有效减轻抗癌药对肿瘤干细胞的杀伤.当前研究指出ABCG2过表达与食道癌、肝癌、胃癌、肠癌等病患抗药性有关,也有报道ABCG2表达与病患预后有关.从这个角度来看,ABCG2在消化系统肿瘤的抗药性和预后中起重要作用.

4.1 ABCG2在肝癌中的作用 在我国,肝癌是第二常见的癌症,每年有超过38万人因此丧生,这一人数占全世界的51%;肝细胞癌在我国男性病患中是第二大致死性肿瘤,在女性病患中则是第三大致死性肿瘤[46].化疗是常用的肝癌治疗手段,但由于存在多药耐药的原因,导致化疗效果堪忧.因此研究新的治疗策略已成为当务之急.通过调控耐药基因表达来提高化疗药敏感性,部分逆转多药耐药可能是治疗肝癌的重要途径之一.王炜等[47]发现苦参素可以下调耐药相关基因ABCB1及其蛋白表达产物P-gp的表达.它可以逆转人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM的多药耐药性.而冯巍巍等[48]在体内研究发现苦参素能下调MRP1 mRNA及蛋白表达,增强多柔比星对人肝癌耐药裸鼠移植瘤的抗瘤作用,逆转多药耐药性.而ABCG2作为ABC家族的成员,在肝癌细胞中表达升高,并与疾病进展密切相关.它是肝癌重要的耐药指标,可能成为未来肝癌治疗的靶点[49].较多研究表明下调ABCG2表达,可增强药物敏感性,提高治疗效果.Zhang等[50]研究发现下调ABCG2表达可以使抗癌药物积累在肝癌细胞中的作用,减少药物外排,增加细胞内药物浓度,提高疗效.Hou[51]通过靶向调控DPAGT1/Akt/ABCG2途径来逆转耐药性并提高肝细胞癌联合治疗的效果.强光辉等[52]发现ABCG2可在多种人肝癌细胞系中表达,而ABCG2过表达与耐药性呈正相关.Huang等[53]发现ABCG2导致索拉非尼外排增加,导致治疗效果不佳;用ABCG2抑制剂治疗后可增强索拉非尼在肝癌细胞中的作用并改善化疗.同时,季伟等[54]研究也发现,siRNA可下调ABCG2表达,使肝癌细胞侵袭力下降,增强阿霉素的药物敏感.Sun等[55]研究表明,MDR1和BCRP可能是肝细胞癌中最重要的抗药性因子;而且,他们mRNA和蛋白表达之间呈正性关系,表明可预测肝癌耐药,可能是多药物耐药的抑制靶点.Guo等[56]研究发现肝脏再生增强剂(ALR)通过抑制AKT/Snail信号传导途径,下调ABCB1和ABCG2表达,可有效抑制多柔比星被泵出细胞、提高细胞内药物浓度而抗肿瘤作用.看来ALR有可能是一种潜在的抗HCC化疗药物.此外,更多研究表明ABCG2在肝癌中的表达与病理分级、临床分期和转移相关.抑制其表达可减少肝癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡[57,58].黄芳等[59]研究发现ABCG2在原发性肝癌中高表达,并且与组织分化及转移有关,提示ABCG2高表达可能在肝癌的病情进展中起作用.它也可能是肝癌病患预后不良的危险要素.Chen等[60]研究发现ABCG2表达与年龄、预后密切相关,发现ABCG2在老人HCC中的表达增加,同时发现ABCG2高表达患者的总体存活率在老年患者中下降.ABCG2基因作为一种重要的耐药蛋白,随着人们对它的研究不断深入,其功能日益显著,但其在肝癌细胞表达的精细调控、耐药的机制及药物逆转等问题尚未明确,有待进一步探究及阐明.

4.2 ABCG2在食管癌中的作用 目前,随着化疗药物及方案的改进,食管癌化疗取得了较大进展,但耐药性仍是影响肿瘤化疗的主要问题之一.其对化疗效果和患者预后有较大影响.陈晓依等[61]发现ABCG2在食道癌组织中的表达率高于癌旁组织.进一步探究发现ABCG2过表达于肿瘤侵犯越深、TNM分期越高、有淋巴结转移的患者.刘慧娟等[62]以免疫组化方法研究显示,与癌旁组织比较,ABCG2在食道癌中高表达,且其与TNM分期密切相关.王勇文等[63]也发现ABCG2在食道癌组织中的表达明显高于癌旁组织,参与癌细胞的增殖、分化、侵袭和转移.为此,有研究表明可通过改变ABCG2表达来调控食管癌多药耐药性.Liu等[64]研究发现Epigallocatechin-3-gallate可下调ABCG2表达,抑制癌细胞生长和诱导食管癌细胞凋亡,同时增加癌细胞中的抗癌药物浓度来逆转多药耐药性.刘亮等[65]检测发现在食管癌细胞中ABCG2基因呈高表达,参与了食管癌耐药形成,调控细胞耐药性.可以看出,ABCG2的表达水平与食管癌的进展有关,这可能是逆转食管癌多药耐药的新方向.

4.3 ABCG2在胃癌中的作用 胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率居全国第二位,居世界第五位.据报道,2012年全世界新发胃癌病患952000例,其中五分之二分布在我们国家[66].手术切除后临床前期胃癌患者的5年生存率可达90%.进展期胃癌则以综合治疗为主,化疗是其主要方法之一,但癌细胞多药耐药的产生使得化疗药物的应用受到明显限制.已有大量研究表明ABCG2的高表达是导致胃癌病患化疗失败的重要原因,其可能是耐药的重要标示物.因此在化疗之前检测患者ABCG2的表达水平,从而选择个体化治疗,提高治疗效果尤为重要.Yu等[67]研究发现5-氟尿嘧啶治疗后残留癌细胞中hedgehog靶基因GLI1和GLI2呈高表达,其与增加侧群、肿瘤球体大小、癌症复发率高有关;下调GLI2可使胃癌细胞对5Fu治疗敏感,降低ABCG2表达,结果说明ABCG2是GLI2相关5Fu抗性的重要介质.张红梅等[68]研究发现 HIF-2α、ABCG2、OCT-4等肿瘤干细胞标记物的癌组织中 mRNA和蛋白的表达水平与病患的化疗效果有关.程浩[69]等研究发现,ABCG2在晚期胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,与TNM分期、分化状态和侵犯深度密切相关.同样,周林艳等[70]也发现癌组织中ABCG2的表达与胃癌的分化及侵袭力有关.梁水清等[71]通过临床分析发现胃癌组织中ABCG2呈高表达,且表达水平与分化程度、淋巴结转移等紧密相关.王昕海等[72]研究认为KEAP1基因突变可增加胃癌细胞的耐药性,其机制可能是通过上调Nrf2及ABCG2的表达.任晓晓等[73]研究发现塞来昔布通过降低HIF-2α-ABCG2和HIF-2α-OCT-4通路的表达提高FOLFOX4方案疗效,影响胃癌的发展和转移,进而影响肿瘤的化疗抵抗、逆转多药耐药.这些研究表明ABCG2在胃癌确诊、恶性度、肿瘤发展及耐药中起作用.因此进一步探究ABCG2如何参与肿瘤产生、生长、肿瘤抗药性的分子作用机制,可为以后临床实践提供新的思路.

4.4 ABCG2在结直肠癌中的作用 研究表明,多药耐药蛋白的表达可影响结肠癌组织对多种化疗药物的疗效,并与肿瘤的分化、转移和预后有关.钟自强等[74]发现苦参素可抑制P-gp的表达,增加细胞内药物浓度,从而逆转结肠癌细胞的多药耐药性.孙锋等[75]研究发现ABCG2低表达使基质金属蛋白酶活性下降而阻止结直肠癌干细胞增殖、侵袭;李刚强等[76]采用免疫组化检测60例大肠癌及正常大肠黏膜组织中ABCG2的表达.结果表明ABCG2在癌组织中的表达高于正常组织,且与肿瘤分化和淋巴结转移有关.Hu等[77]研究报道也提示ABCG2表达与TNM分期、肿瘤分化和淋巴血管侵袭相关,并且ABCG2表达与右侧结肠癌复发和不 良预后相关.赵炳军等[78]研究结果发现MDR1、MRP1及ABCG2在结直肠腺癌的阳性表达率显著高于正常组织,且其表达与病理学分级、淋巴结转移及Duke分期密切相关,但与年龄、性别及肿瘤发生部位无关,它们之间的表达呈显著正相关,因此它们可能在结直肠癌侵袭转移中存在协同作用.不过有研究表明可通过各种途径下调ABCG2表达来提高化疗敏感性.赖子君等[79]研究发现白花蛇舌草通过下调移植瘤组织中ABC转运蛋白的mRNA和蛋白表达来抑制5-Fu耐药大肠癌裸鼠移植瘤的生长.学者陈耀[80]应用CRISPR-Cas9技术敲除ABCG2能使结直肠癌细胞胞内药物积累增加、提高细胞株的药物敏感性,从而抑制结直肠癌的恶性生物学行为.Hu等[81]研究发现侧群结肠癌细胞比非侧群细胞在体内具有更高的致瘤性,并且表现出更高侵入性特征和更强的形成集落的能力,可能与这些细胞更高表达多药抗性蛋白ABCG2有关;后来他们通过用针对ABCG2的发夹样小干扰RNA(siRNA)真核表达质粒转染侧群细胞,结果显示可增加化疗敏感性.因此,进一步探讨如何调控多药耐药蛋白对结直肠癌的增殖、分化、侵袭等影响至关重要.另外,检测ABCG2表达对选择化疗药物、优化化疗方案及评估患者预后等具有重要指导意义.

5 结论

ABCG2是ABC转运蛋白大家族中的新成员,它不仅与肿瘤多药耐药密切相关,而且新的研究表明其尚有待挖掘的新功能.虽对ABCG2的研究已久,但进展较缓慢,一些重要问题尚待深入研究.比如ABCG2与肿瘤天然耐药及获得性耐药的关联、其与肿瘤临床病理特点及预后的关联、其表达与干细胞特性、其基因表达的精细调控以及其如何参与细胞分化及肿瘤发生、发展等诸多问题,许多研究领域尚未得到确切的研究结果.因此,进一步的研究将深化对ABCG2的认识,探讨其新功能及其临床耐药机制、耐药逆转,对研发新药、提高化疗效果具有重大意义.