茶树有机磷类农药降解菌的筛选及其在速溶茶生产中的应用

王晓霞，邵增琅，唐杏燕，裴少芬，黄鸣，黄叶飞

（南京融点食品科技有限公司速溶茶工程研究中心，江苏南京 211300）

茶树（Camellia sinensis）为多年生木本植物，在长期的生长过程中，已形成独特的内生菌群[1]。茶树内生菌种类繁多，资源丰富，以茶树内生菌及其代谢物作为农用价值的菌株和化合物所开展的研究正在兴起[2]。有机磷类农药在化学结构上属于有机磷酯，是目前用量最多、使用范围最广的农药，属于神经毒素，其残留对人等非靶标生物有一定毒性效应[3]；引起中毒的作用机理是抑制体内的胆碱酯酶，使其失去分解乙酰胆碱的能力，从而造成体内乙酰胆碱的积累，刺激中枢神经系统，使各项功能失调，引起生理紊乱[4]，因此去除有机磷类农药的残留尤为重要。此外，农药残留是影响我国速溶茶出口的主要问题，特别是近几年，欧盟对茶叶农残项目的规定不断增多，限值大幅降低，我国茶叶出口企业受到了很大冲击，因此茶产品农残问题的解决迫在眉睫[5]。

近年来，对茶树内生真菌的研究主要集中在内生菌的分离方法、分布规律、不同地区优势菌种的鉴定、生物学作用等方面[6]，但对功能性内生真菌的研究，尤其是关于农药降解菌的筛选及应用却鲜有报道。研究就目前速溶茶生产中的农药残留问题，通过从茶树内生真菌中筛选出能降解有机磷类农药残留的功能性内生真菌菌株，并将其应用于速溶茶生产工艺，初步探讨功能性内生真菌在速溶茶生产中的应用效果和产业化的可能性，为研究茶树内生菌寻找新的功能基因和活性物质提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

提取用的绿碎茶原料购自黄山一品有机茶叶有限公司；内生真菌菌株筛选自江苏省南京市紫金山中山陵的“龙井长叶”茶树。

甲胺磷、甲基毒死蜱、杀螟硫磷、水胺磷、杀扑磷、乙硫磷及三唑磷的标准品购自农业部环境保护科研监测所。

1.2 仪器设备

LRH-250生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；HZQ-F160型全温振荡培养箱 （太仓市实验设备厂）；LDZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；DHG-9003BS电热恒温鼓风干燥箱 （上海新苗医疗器械制造有限公司）；TU-1810DS紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SW-CJ-ID型双人净化工作台（苏州净化设备有限公司）；TDL-5-A型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；MTN-2800D氮吹浓缩装置 （天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；安捷伦7890A气相色谱仪（上海申安医疗器械厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基的制备

PDA培养基：马铃薯20.0 g煮沸30 min，葡萄糖2.0 g，琼脂1.7 g，蒸馏水100 mL；121℃灭菌20 min。

PDB培养基：马铃薯200.0 g煮沸30 min，葡萄糖 20.0 g，蒸馏水1000 mL；121℃灭菌20 min。

有机磷农药液体培养基：PDB培养基中用100 mg/L甲基毒死蜱、100 mg/L水胺磷、100 mg/L三唑磷代替葡萄糖作为唯一碳源，121℃灭菌20 min，待用。

有机磷农药固体培养基：PDA培养基中用100 mg/L甲基毒死蜱、100 mg/L水胺磷、100 mg/L三唑磷代替葡萄糖作为唯一碳源，121℃灭菌20 min，待用。

茶水发酵培养基：绿碎茶100.0 g，水1300 mL，93℃浸提 30 min，纱布过滤去除茶渣；121℃灭菌20 min。

1.3.2 农药降解菌的富集驯化和筛选

参照徐刚明[7]的方法进行农药降解菌的富集驯化和高效降解菌的筛选分离。采集喷施过农药的直径为0.5 mm以上的健康枝条。将采回的样本叶片摘下，用75%酒精浸泡30 s，再用无菌水漂洗，自然晾干后用于内生真菌的分离、培养。从每张叶片中用无菌解剖刀在距叶柄约1/3处沿主脉切开，切取约0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，经表面消毒后，用含甲基毒死蜱、水胺磷和三唑磷各5 mg/L的PDB培养基于30℃、200 r/min富集培养7 d后，取10%转接至新鲜培养基中并将农药浓度提高一倍，如此连续转接5次，直至农药浓度提高到160 mg/L。富集培养结束后，离心发酵液收集菌体，转接到以甲基毒死蜱、水胺磷和三唑磷为唯一碳源的PDB培养基中连续继代培养筛选，然后用稀释平板法筛选直至分离获得纯化的菌株。菌种用甘油管低温保藏。

1.3.3 农药降解菌在速溶茶生产中的应用

将筛选出的菌株制成菌悬液接种到有机磷农药液体培养基中，测定菌株生长情况；将生长旺盛的菌接种于茶水发酵培养基中发酵培养，每隔1 d，取发酵液过滤、浓缩、灭菌、喷干后测定喷干茶粉的农药残留。

1.3.4 测定方法

生长曲线测定。菌体生长量用分光光度法[8]测定。在波长600 nm处测定吸光值，用OD600表示，图表中OD600值均为菌体发酵液吸光值减去不接菌培养基吸光值。

有机磷农药残留测定。采用气相色谱法[9]：在活性炭固相萃取柱上端装入1 cm高的无水硫酸钠，用乙酸乙酯2 mL预淋洗小柱，弃去流出液，然后将离心净化后的发酵液倾入柱中，再分别用4 mL乙酸乙酯，2 mL乙酸乙酯、正己烷混合液（体积比1∶1）洗脱，收集全部洗出液于氮吹管中，于40℃下氮气流吹至0.5 mL，供气相色谱分析。色谱柱：DB-1701毛细管柱子 （30 m×0.3 mm×0.25 μm）；升温程序：80 ℃→40℃（升温）→150 ℃（8 ℃升温）→250 ℃（8 min）；温度条件：进样口温度250℃，柱温250℃，检测器温度230℃。

1.4 数据处理

采用SAS软件进行数据统计与处理。

2 结果与分析

2.1 有机磷类农药降解菌的筛选

试验前期通过公司生产的速溶茶粉进行有机磷类农药残留测定，发现主要的农残为甲基毒死蜱、水胺磷和三唑磷，因此有针对性地筛选能有效降解这三种农残的茶树内生真菌。通过PDA培养基初筛和有机磷农药固体培养基富集驯化，从龙井茶叶片上筛选分离得到了4株具有较强降解甲基毒死蜱、水胺磷和三唑磷的菌株，分别命名为ES-1、ES-2、ES-3 和 ES-4，如图 1 所示。

从图1可以看出，富集驯化的4株菌在含有100 mg/L甲基毒死蜱+100 mg/L水胺磷+100 mg/L三唑磷的固体培养基上形成了明显的降解透明圈，其中ES-4透明圈的直径明显大于其他3株菌。

图1 4株菌在有机磷农药固体培养基上的降解透明圈Fig.1 The degradation of transparent circle of the 4 fungi in the organic phosphorus pesticides solid medium

将这4株菌接种于有机磷农药液体培养基中，测定菌体生长情况。从图2可以看出，4株菌的生长情况较好，其中ES-2延滞期较长，稳定期较短，其他3株菌延滞期均较短，而稳定期较长。在同样的培养条件下，以ES-4生长情况最好，便于扩大培养。

图2 4株菌在有机磷农药液体培养基中的生长情况Fig.2 The growth curve of 4 fungi in the organic phosphorus pesticides liquid medium

2.2 用ES-4农药降解菌降解速溶茶中的农药残留

从“2.1”的培养结果和降解结果可知，ES-4的生长和降解能力均强于其他3株菌，因此选用ES-4作为速溶茶中的农药降解菌。

用ES-4降解速溶茶中有机磷农药残留的技术路线如图3所示。

图3 ES-4降解速溶茶中有机磷农药残留的技术路线Fig.3 Technical roadmap of degradation of organophosphorus pesticide residues in instant tea by ES-4

将ES-4菌悬液按10%接种量接种于茶水发酵培养基中，30℃、200 r/min条件下摇床培养2 d。将发酵液用8层纱布过滤，浓缩、灭菌、喷干后得速溶茶粉。

分别配制一系列浓度的有机磷农药标准溶液，按照“1.3.4”农药残留测定方法进样，测定速溶茶粉中的农药残留。如图4所示。

试验检测了黄山一品绿碎茶浸提液喷干茶粉中的农药残留，如图4B所示，主要为甲基毒死蜱、水胺磷和三唑磷。将绿茶浸提液灭菌后，接种ES-4发酵，从图4 C中可以看出，用ES-4发酵1 d后，发酵液喷干茶粉中未检测甲基毒死蜱和水胺磷，说明ES-4能快速分解利用甲基毒死蜱和水胺磷。如图4D所示，发酵2 d的喷干速溶茶粉中依然能够检测出三唑磷，但与发酵1 d和未发酵的速溶茶相比有所减少，这说明ES-4菌株对三唑磷的降解利用比较缓慢。

3 讨论

文章通过在有机磷农药培养基中产生透明圈的方法[10]，得到了4株降解有机磷农药的菌株，以ES-4降解效果最好，能有效降解甲基毒死蜱和水胺磷类农药。菌株对有机磷农药的降解，多是因为菌株所产生的有机磷农药降解酶对有机磷农药的降解作用[11]。目前对于利用微生物降解有机磷农药已有大量的报道，能够分离到的微生物种类繁多，但由于微生物代谢途径的多样性，其降解机理也不尽相同。通过研究者多年的研究认为，微生物对化合物的降解作用简单来说分为三步，首先化合物在微生物细胞表面吸附，其次化合物进入到微生物细胞内，最后化合物在微生物细胞内被降解[12]。

关于通过筛选茶树内生菌降解农药残留方面的研究，目前的报道仅有洪永聪等[13]以不同茶树品种的健叶和病叶为研究对象，分离、筛选和鉴定内生细菌，分离得到了14株在氯氰菊酯平板上生长良好的菌株，这14个目标菌株对氯氰菊酯都有不同程度的降解作用，其中TL10、TL7和TL2对氯氰菊酯的降解效能较高，从时间上来看，6～48 h内目标菌株对氯氰菊酯的降解率呈直线增长，而48 h后降解率就没有太大变化，并经鉴定，菌株TL2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；王兆守等[14]以福州某茶园经农药处理过的茶叶为研究材料，通过以农药为唯一碳源的基础培养基连续筛选。分离农药降解菌，获得了一株标号为c1f6的菌株，经鉴定为假单胞菌属的一个未知种，该菌株对拟除虫菊酯类农药联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯均有较明显的降解作用，同时菌株c1f6对有机磷农药也有一定的降解，3 d对甲胺磷和毒死蜱的降解率分别为27.67%和12.35%。

内生菌是植物的天然资源菌，对寄主植物有促生、防病、内生固氮、杀虫、降解重金属、农药及有机污染物等多方面的生物学功能[13]，研究茶树内生菌的生物学功能，将为茶树内生菌资源库的建立打下基础，同时对茶生产过程中农药残留的治理等也将起到积极的促进作用，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景，文章只是初步筛选出能有效降解有机磷（水胺磷和甲基毒死蜱）的茶树内生真菌ES-4，但ES-4的株菌类型、降解机理尚不明确，所以后续需要对ES-4做进一步的分子鉴定，并对其降解机理做详细研究；同时考虑到ES-4应该是只能耐受三唑磷农药，但不能将其有效降解，因此，有必要再有针对性的筛选降解三唑磷的内生菌，同时考虑将两种或几种能够降解有机磷农药的菌株混合发酵培养[15]，以达到预期的效果。

图4 有机磷农药色谱图Fig.4 Chromatogram map of organic phosphorus pesticides