茶树产多酚氧化酶内生真菌的筛选及其在速溶茶生产中的应用

王晓霞，邵增琅，唐杏燕，裴少芬，黄鸣，黄叶飞

（南京融点食品科技有限公司速溶茶工程研究中心，江苏南京 211300）

植物内生真菌（Endophytic Fungi）是指生活在植物寄主中并度过全部或近乎全部生活周期，而对寄主植物并不引起明显病害的真菌[1]。近年来，内生真菌由于物种丰富，数量庞大，且与其它生物之间生态关系紧密，成为天然活性物质的潜在来源，引起国内外研究者的广泛关注[2]。相对于其它植物内生真菌，茶树内生真菌的研究起步相对较晚，一般集中于不同茶树、不同部位菌种的分离差异和内生真菌抗菌活性的筛选，未见将功能性茶树内生真菌应用于速溶茶生产的报道。茶树中含有茶多酚、咖啡碱和茶氨酸等多种次生代谢产物，基于内生真菌能够和寄主植物互作的原理，有可能发现产生和转化这些活性物质的内生真菌菌株。

多酚氧化酶是茶树中普遍存在的一种酶，是红茶加工中品质形成的关键酶类，可催化氧化儿茶素类物质形成茶黄素、茶红素类色素，对红茶色、香、味等品质的形成具有关键作用[3]。多酚氧化酶在速溶红茶加工中的重要作用受到广泛关注和研究。

近些年，随着冰红茶饮料的迅猛发展，大大增加了速溶红茶的需求量。由于常规速溶红茶生产必须以红茶作为提取原料，而当前红茶原料供需矛盾突出，但低档绿茶和乌龙茶原料供应充分，于是很多速溶茶生产企业以绿茶或乌龙茶为原料，通过碱转溶法制备速溶红茶，但是碱转溶速溶红茶存在茶汤汤色深暗、转溶气味浓、口感单薄等问题，用在冰茶中勉强可用，在奶茶类产品中则无法满足优质奶茶汤色粉红或黄红明亮、口感浓醇爽滑的品质要求[4]。研究就目前速溶茶生产中存在的碱转溶速溶红茶品质差等问题，从茶树内生真菌中筛选出产多酚氧化酶的内生真菌菌株，并将其应用于速溶茶的生产工艺中，初步探讨产多酚氧化酶内生真菌在速溶茶生产中的应用效果和产业化生产的可能性，为功能性茶树内生真菌的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

提取用的绿碎茶原料购自黄山一品有机茶叶有限公司；内生真菌菌株筛选自江苏省南京市紫金山中山陵茶厂中种植了十年的 “龙井长叶”茶树。

茶多酚购自大闽食品（漳州）有限公司。

1.2 仪器设备

LRH-250生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；HZQ-F160型全温振荡培养箱 （太仓市实验设备厂）；LDZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；DHG-9003BS电热恒温鼓风干燥箱 （上海新苗医疗器械制造有限公司）；TU-1810DS紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SW-CJ-ID型双人净化工作台 （苏州净化设备有限公司）；2100N台式浊度仪（哈希公司）；Lovibond PFX195比色计 （深圳鼎鸿运贸易科技发展有限公司）；PHS-25型数显pH计 （上海仪电科学仪器股份有限公司）；TDL-5-A型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；SPD-1SC高效液相色谱仪（岛津企业管理（中国）有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基的制备

PDA培养基：马铃薯20.0 g煮沸30 min，葡萄糖2.0 g，琼脂1.7 g，蒸馏水100 mL；121℃灭菌20 min。

PDB培养基：马铃薯200.0 g煮沸30 min，葡萄糖20.0 g，蒸馏水1000 mL；121℃灭菌20 min。

茶多酚液体培养基：PDB培养基中添加茶多酚0.4 g/L。

茶多酚固体培养基：PDA培养基中添加茶多酚0.4 g/L。

茶水发酵培养基：绿碎茶100.0 g，水1300 mL，93℃浸提 30 min，纱布过滤去除茶渣；121℃灭菌 20 min。

1.3.2 内生菌的筛选

参考陈烟兰等[5]的方法，在茶园中随机采集直径为0.5 mm以上的健康茶树枝条。将采回的样本叶片摘下，用75%酒精浸泡30 s，再用无菌水漂洗，自然晾干后用于内生真菌的分离、培养。从每一叶片中用无菌解剖刀在距叶柄约1/3处沿主脉切开，切取约0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，经表面消毒后，在装有50 mL茶多酚液体培养基的250 mL三角瓶中，于28℃、180 r/min条件下富集培养耐茶多酚的茶树内生真菌，每一个三角瓶各放入茶叶组织块5个。培养一定时间后将茶叶组织块上出现的真菌菌丝分别移接到PDA培养基上，进行纯化、编号保存。菌种用甘油管低温保藏。

1.3.3 内生菌在速溶红茶生产中的应用

将筛选出的产多酚氧化酶较强菌株制成菌悬液，以相同接种量单独或混合接种到茶多酚液体培养基中，测定菌株生长情况；将生长旺盛的菌株接种到茶水发酵培养基中，于28℃、180 r/min条件下摇床培养4 d，每隔1 d取发酵液，将发酵液用8层纱布过滤、浓缩、灭菌、喷干后观察汤色、测定色度、茶多酚含量及其它相关指标。

1.3.4 测定方法

生长曲线测定。菌体生长量使用分光光度法测定[6]，在波长600 nm处测定吸光值，用OD600表示，图表中OD600值均为菌体发酵液吸光值减去不接菌培养基吸光值。

茶粉汤色变化。对茶粉汤色变化进行拍照，并用色度仪测定色度值L*、a*、b*值的变化。

理化指标测定。喷干茶粉中茶多酚含量采用GB/T 8313—2018[7]中的HPLC法测定，咖啡碱采用GB/T 8312—2013[8]中的紫外分光光度法测定；pH和浊度分别采用数显pH计和台式浊度仪测定。

1.4 数据处理

采用SAS软件进行数据统计与处理，通过ANOVA方式，采用Duncan’s multiple range tests对不同处理之间的差异性在p＜0.05及p＜0.01水平上进行分析。

2 结果与分析

2.1 产多酚氧化酶菌株的筛选

通过PDA培养基初筛和茶多酚固体培养基复筛，从茶树叶片组织中分离得到了5株能在茶多酚培养基中较强较快产生红褐色氧化圈的菌株， 分别命名为 EC-1、EC-2、EC-3、EC-4 和 EC-5，如图 1。

将这5株菌转接到茶多酚液体培养基中，测定其生产情况。从图2（A）可以看出，这5株菌均能较好地在茶多酚液体培养基中生长，它们在茶多酚液体培养基中的延滞期均较短，其中EC-1发酵培养3天后开始进入衰亡期，其生长量也较其它菌株少，EC-2和EC-5生长量接近，EC-5略低。菌株EC-4在茶多酚培养基中生长最好，其发酵液变色也最明显，说明其产多酚氧化酶的能力最强[9]，EC-3生长也很好。

将在茶多酚液体培养基中生长最好的两株菌EC-3和EC-4分别单独和1∶1混合转接到新的茶多酚液体培养基中，测定其生长情况。从图2（B）可知，EC-3和EC-4在茶多酚培养基中的延滞期非常短，说明这两株菌已经完全适应了茶多酚培养基的营养环境，其中EC-3较EC-4早进入生长稳定期，也早进入衰亡期，EC-4比EC-3生长地更好；而EC-3和EC-4混合发酵，其生长要比两者单独发酵更好，可能是混合培养时两菌之间发生直接或间接的相互作用，互相提供所需的营养，转移或消除抑制产物，或通过一些物理或生化机制刺激彼此间的生理活性[10]。因此，选择EC-3和EC-4混合菌发酵绿茶浸提液制备速溶红茶更适宜。

2.2 EC-3和EC-4混合发酵绿茶提取液制备速溶红茶

用 EC-3 和 EC-4 混合菌悬液（1∶1）按 6%接种量混合发酵绿茶提取液制备速溶红茶，技术路线如图3所示。喷干后茶粉汤色变化如图4所示，理化指标如表1所示。从图4可以看出，随着发酵时间的延长，茶水汤色越来越接近红茶特有的品质，在发酵第3 d的时候，茶水汤色红艳明亮，金圈厚亮，香气清爽纯正、浓郁持久，滋味醇厚，具有红茶特有的风味。说明EC-3和EC-4混合菌能够很好地利用绿茶提取液进行发酵，产生多酚氧化酶，将茶水中的儿茶素类物质氧化成茶黄素、茶红素和其他氧化聚合物[11]。另外，氧化3 d的茶汤金圈饱满厚亮，说明红茶特征性指标茶黄素[4]含量较高；发酵第4 d的汤色红艳，金圈减少，说明此时茶汤中茶红素含量过高，氧化过度，故用EC-3和EC-4混合发酵3 d最为适宜。

从表1可知，随着发酵时间的进行，茶汤中茶多酚、咖啡碱以及色度值中的L*、a*值变化显著（p＜0.01），茶多酚含量明显减少，咖啡碱含量也逐渐减少；色度值中L*逐渐增大，说明混合菌还具有澄清茶汤的作用，可能是混合菌发酵不仅会产生多酚氧化酶，还会产生少量的其它酶类，比如产生单宁酶，使茶汤逐渐变得透亮；a*和b*值逐渐增大，说明茶汤逐渐变红变黄，这和感官看到的汤色变化一致。茶汤的浊度也逐渐减少，这和L*变化应该是一样的原因；发酵过程中茶汤的pH逐渐增大，根据微生物的生长特点，一般发酵液的pH应该是先降低后升高[12]，而试验中发酵液pH逐渐增大，这可能跟测定时间有关，从上面的试验结果可以知道，菌株EC-3和EC-4延滞期较短，当发酵液中的碳源利用完后，菌体相对较多地利用氮源，导致发酵液pH值上升[13]。

图1 株菌在茶多酚固体培养基上的颜色反应Fig.1 The color reaction of fungi on the tea polyphenols solid medium

图2 株菌在茶多酚液体培养基中的生长情况Fig.2 The growth curve of the fungi on the tea polyphenols liquid medium

图3 内生菌制备速溶红茶的技术路线Fig.3 Technical roadmap for preparation of instant black tea by endophytic fungi

图4 速溶红茶粉汤色随发酵时间的变化Fig.4 Change of the liquor color of instant black tea with fermentation time

表1 速溶红茶粉理化指标随发酵时间的变化Table 1 Change of chemical compontents of instant black tea powder with fermentation time

3 讨论

近年来，对茶树内生真菌的研究得到了快速发展，但在研究程度上存在“初步研究多，深入研究和应用少”的特点[14]，研究的质量、应用面、实用性提升的空间依然很大。茶叶中含有多种天然活性物质，是生物转化先导化合物的资源宝库[14]，目前研究较多的依然是茶多酚的生物转化，其他成分的生物转化研究较少，后续有必要进一步扩大研究面，为茶树功能性成分的开发利用打下基础。

文章通过在茶多酚培养基中显色的方法[15]，从茶树叶片组织中分离得到了5株产多酚氧化酶的菌株，说明这些真菌可以利用茶多酚作为营养而生长。这些产多酚氧化酶的菌株中，以EC-3和EC-4混合发酵效果最好，说明其分泌酶的能力最高；通过EC-3和EC-4混合发酵绿茶提取液制备速溶红茶的效果可知，从茶树中分离得到的产多酚氧化酶的菌株能实现绿茶提取液氧化制备速溶红茶，且氧化效果可观，这一研究结论对茶叶深加工行业是一大突破，同时也为茶叶深加工产品提供了新的开发方向。研究虽通过鉴别培养基平板筛选的方法获得了目标菌株，将其应用于速溶茶的生产得到了理想的效果，但并未对筛选的菌株作生物学鉴定，还需进行后续工作。另外，考虑到微生物酶系成分复杂，种类多[16]，因此对产生的氧化酶的性质还有待进一步的酶学分析[17]。