关于滇重楼内生真菌抗菌活性的筛选和菌株鉴定研究

代娇 宋秋玲 田甜

摘要：采用实验分析的方法，依靠实验进一步分析了滇重楼的真菌抗菌活性及其菌株鉴定结果。从实验结果来看，滇重楼中的金黄色葡萄球菌具有理想的抗菌活性，并且菌株鉴定结果显示，该菌株为墙粘鞭霉，因此应该得到相关人员的关注。

关键词：滇重楼;内生真菌抗菌活性;菌株鉴定

前言：

滇重楼是一种广泛分布于云南、贵州等地区的药材，其根茎可以用药，具有良好的清热解毒、消肿止痛的功能，在临床上常被用于治疗咽喉肿痛、毒蛇咬伤等症状，其效果显著。内生真菌是指生活在植物组织内部而不影响植物组织明显症状的真菌，内生真菌可以分泌毒素或者抗菌物质，影响了药物的临床应用。

1.实验与材料分析

1.1原材料的选择

在本次研究中，选取10株滇重楼为研究对象，所选药物均为当地化学与生物技术学院保存的菌种。

本次研究中的培养基为：PDA（马铃薯培养基）、NB（牛肉蛋白胨培养基）与固体发酵培养基。

1.2对原材料的处理

将本组10株滇重楼发酵物用95%乙醇浸泡之后，超声处理30min，并用纱布做好过滤;之后取菌丝体，将其加入到80%的丙酮中进行浸泡处理，在经真空泵抽取之后，做好过滤。此时向滤液中添加100ml的乙醇乙酯，之后萃取乙酸乙酯层，并将其与萃取液合并在一次。之后萃取液在经过40℃的减压蒸馏之后，可以干燥处理，这样就能获得粗提取物浸膏。最后，提取100mg的提取物浸膏，并通过1ml无水乙醇完全溶解之后，将最终处理的后获得的抗菌实验样品为实验品。

1.3发酵物的抗菌活性检测

采用滤纸片扩散法进行发酵物的抗菌活性检测，将试菌培养液均匀涂抹在抗菌实验样品上，之后在NB平板上的适当位置粘贴蘸取了待测菌种发酵物乙醇提取物的滤纸片，同时选取100μg/ml无菌水与青霉素进行对照，在37℃环境下来培养1d时间，观察细菌的生长情况，并按照交叉法来测量抑菌圈的变化，评估抑菌效果。

1.4抗菌活性菌株鉴定

在本次研究中，为了能够获得更理想的抗菌活性菌株鉴定结果，需要对具有较高抑菌活性的真菌进行形态学与分子学鉴定，这样就能确定具体的抗菌活性水平。之后在对菌株的活性鉴定过程中，通过PDA培养基進行插片，并按照分离后获得的滇重楼植物内生真菌的形态特征资料，并将最终的分析结果来进行分属鉴定。

2.对滇重楼内生真菌抗菌活性的筛选和菌株鉴定结果的分析

2.1内生真菌的抗细菌活性分析

在按照上述方法进行实验之后，对内生真菌的抗菌活性情况进行了分析，通过实验结果可以发现，在本次所选择的10株滇重楼中，由三株无抗菌活性，而另外7株只对黄金色葡萄球菌具有一定的抑制作用，并且对大肠杆菌与产气肠杆菌无抑制作用，详细资料如表1所示。

2.2抗菌活性的内生真菌形态鉴定

在对抗菌活性的内生真菌形态进行鉴定之后，鉴定结果显示，滇重楼菌株属于粘鞭霉属，这种真菌的主要特征为：培养过程中可以发现菌丝束，并且外表呈现出白色，且分生孢子聚集之后，其颜色相对暗（相关资料见图1）。

2.3抗菌活性的内生真菌分析鉴定

鉴定结果显示，真菌中的PCR扩增条带具有亮度高、特异性高等优点，并且在对真菌的规格进行分析之后，发现大部分真菌的大小为500-700bp。根据这一结果可以发现，本次研究中扩增出的序列可能为ITS序列，因此可以采用测序分析的方法类来进行内生真菌分析鉴定。之后，按照这一要求技术人员将测序的结果提交给GenBank，之后获得具体的登入号。

2.4对分析结果的深入研究

滇重楼内生真菌的活性筛选与菌株鉴定具有特异性，这一点在植物生长过程中，确实伴随大量内生真菌共生的情况，其中依然可以发现大量与宿主相同或者基本相似的生物活性物质[1]。对于相关人员而言，必须要正确认识到滇重楼的药用价值，该药物的根茎中含有足够的甾体化合物，从临床应用情况来看，滇重楼具有理想的抗微生物、止血等作用。

结论：

从本次研究结果可知，滇重楼内生真菌抗菌活性具有特殊性，可以帅筛选到了具有抗金黄色葡萄球均活性，并且研究结果也证明，滇重楼内的次生代谢物中含有一定量的抗生素环孢菌素C，证明滇重楼内的抗菌活性水平理想。因此在未来工作中，需要通过开展深入研究来判断其次生代谢产物中的抗菌活性水平，这对于提高滇重楼的临床药用价值具有重要意义。

参考文献：

[1]李静.滇重楼内生真菌及其抗菌活性检测和甾体化合物分析[D].四川农业大学，2017.