细胞间黏附分子-1在支气管哮喘儿童支气管黏膜中的表达及其对支气管上皮细胞凋亡的影响

周 洁，吉 玲，王新华，周栩平

(1.驻马店市中心医院新生儿科，河南 驻马店 463000；2.郑州大学第三附属医院新生儿科，河南 郑州 450000)

哮喘是一种常见的呼吸系统疾病，其发病率呈上升趋势，给患者及其家庭带来严重影响[1-4]。哮喘的发生与支气管上皮细胞凋亡有关，研究支气管上皮细胞凋亡水平对探讨哮喘的发病机制具有重要作用[5]。细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)属于免疫球蛋白超家族的成员之一，在呼吸道上皮反应中起重要作用，其在白细胞渗出、细胞信号转导、转录因子活化等过程中均起作用[6]。呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)是诱发支气管炎、肺炎等呼吸系统疾病的主要原因，严重威胁免疫低下患者的生命健康[7]。有研究显示，ICAM-1在支气管上皮细胞黏附和炎症反应中具有重要作用，其还是多种病毒的受体蛋白[8-9]。目前，ICAM-1在支气管上皮细胞凋亡中的作用尚不清楚。本研究通过检测哮喘儿童支气管黏膜组织中ICAM-1水平，并用RSV感染支气管上皮细胞，探讨ICAM-1在哮喘支气管上皮细胞凋亡中的作用，以期为研究哮喘的发病机制提供参考。

1 材料与方法

1.1材料收集驻马店市中心医院2014年5月至2017年12月收治的28例支气管哮喘儿童的支气管黏膜组织标本，男16例，女12例，年龄4～13(8.0±0.3)岁；同时选取28例支气管扩张非哮喘儿童的支气管黏膜组织作为对照，男13例，女15例，年龄6～14(10.0±0.8)岁。支气管黏膜组织来源于纤维支气管镜检查，组织标本采集均征得患者及家属同意，并经医院医学伦理委员会批准同意。

1.2细胞、试剂与仪器支气管上皮细胞16HBE购自上海歌凡生物细胞库，RSV由购自上海邦奕生物科技有限公司的酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒保存；ICAM-1 siRNA购自上海西宝生物科技股份有限公司，反转录试剂盒购自德国Qiagen公司，实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)检测试剂盒购自美国Abcam公司，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,Cleaved Caspase-3)抗体、核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65，NF-κB p65)抗体购自美国CTS公司；紫外分光光度计UV-2450购自日本岛津公司，6孔板细胞爬片购自上海晶安生物科技有限公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.3实验方法

1.3.1qRT-PCR检测支气管黏膜组织中ICAMmRNA表达按照RNA提取试剂盒说明书提取正常支气管黏膜组织和哮喘支气管黏膜组织中的RNA，紫外分光光度计检测提取的RNA的浓度和纯度，-80 ℃保存。使用cDNA合成试剂盒进行反转录，qRT-PCR测定不同支气管黏膜组织中ICAM-1 mRNA的表达。ICAM-1上游引物序列为5′-GCGACCACGGACGGAATTTCT-3′，下游引物序列为5′-TCAGGACCCTAGTCGGAAGATCGA-3′。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge-nase，GAPDH)上游引物序列为5′-CGGAGTCAA-CGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物序列为5′-AGC-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。qRT-PCR反应程序为：94 ℃，45 s；58 ℃，60 s；72 ℃，80 s，共35个循环。以GAPDH为内参，2-△△Ct法计算不同支气管黏膜组织中ICAM-1 mRNA表达水平。

1.3.2Westernblot法检测支气管黏膜组织中ICAM-1蛋白表达用蛋白提取试剂盒提取正常支气管黏膜组织和哮喘支气管黏膜组织中的总蛋白。用二喹啉甲酸法对蛋白进行定量检测。使用6孔板，每孔添加30 μg的蛋白样品，与Loading buffer以同体积混合，100 ℃煮沸5 min。给予90 V电压，电泳至溴酚蓝达到分离胶和浓缩胶边缘时，将电压调整至120 V，继续电泳至溴酚蓝进入分离胶的底部。在室温条件下，50 g·L-1牛血清白蛋白封闭 90 min，同时分别加入ICAM-1一抗(11 000)、GAPDH一抗(11 000)，4 ℃下反应过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(12 000)室温孵育 90 min。Osyssey扫描图像，ICAM-1蛋白相对表达量=ICAM-1灰度值/GAPDH灰度值。

1.3.3细胞培养与分组支气管上皮细胞16HBE用含体积分数10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。将正常培养的支气管上皮细胞16HBE分为对照组、感染组、阴性组和干扰组。对照组细胞正常培养，不做任何处理；感染组细胞感染RSV，但不进行转染；阴性组细胞转染siRNA-control后感染RSV；干扰组细胞转染ICAM-1 siRNA后感染RSV。当支气管上皮细胞16HBE融合为60%时，用Lipofectamine 2000进行转染，步骤参照转染试剂盒说明书。RSV感染步骤参照文献[10]，当16HBE细胞融合为65%左右时，加入不含血清的培养液洗涤3次，在细胞中添加感染复数=0.006 7的RSV病毒悬浮液(用不含血清的培养液配制)，37 ℃孵育2 h。用不含血清的培养液洗涤细胞2次，加入细胞培养液继续培养。

1.3.4qRT-PCR和Westernblot法检测各组细胞中ICAM-1mRNA和蛋白水平各组细胞干预处理后继续培养48 h，qRT-PCR和Western blot法检测细胞中ICAM-1 mRNA和蛋白水平，步骤同“1.3.1、1.3.2”项。

1.3.5流式细胞术检测各组细胞凋亡情况对照组、感染组、阴性组、干扰组干预处理后继续培养 48 h，收集细胞，加入胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1离心 10 min，弃上清液，加入预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)将细胞重悬后，1 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)、5 μL 膜联蛋白(Annexin)-V-异硫氢酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)(Annexin-V-FITC)，室温、避光反应20 min，再加入400 μL结合缓冲液，1 h 内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.3.6ELISA法检测各组细胞培养基上清液中IL-1β、TNF-α水平对照组、感染组、阴性组、干扰组细胞在干预处理后继续培养48 h，收集各组细胞培养基上清液，ELISA法测定培养基上清液中IL-1β、TNF-α水平，严格按照IL-1β和TNF-α检测试剂盒说明书进行操作。

1.3.7Westernblot法检测各组细胞中CleavedCaspase-3、NF-κBp65蛋白水平对照组、感染组、阴性组、干扰组细胞在干预处理后继续培养48 h，收集各组细胞，提取细胞中的总蛋白，用Western blot法检测细胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平，Cleaved Caspase-3、NF-κB p65一抗分别以1800和1600稀释，其他步骤同“1.3.2”项。

2 结果

2.1ICAM-1mRNA和蛋白在不同支气管黏膜中表达比较结果见图1。正常支气管黏膜组织和哮喘支气管黏膜组织中ICAM-1 mRNA的表达水平分别为1.00±0.13和2.64±0.25，ICAM-1 蛋白表达水平分别为0.32±0.02和1.05±0.14。哮喘支气管黏膜组织中ICAM-1 mRNA和蛋白水平显著高于正常支气管黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

1：正常支气管黏膜组织；2：哮喘支气管黏膜组织。

图1不同支气管黏膜组织中ICAM-1蛋白表达(Westernblot)

Fig.1ExpressionofICAM-1proteinindifferentbronchialmucosatissues(Westernblot)

2.2各组支气管上皮细胞16HBE中ICAM-1mRNA和蛋白表达比较结果见图2。对照组、感染组、阴性组、干扰组细胞中ICAM-1 mRNA表达水平分别为1.00±0.12、2.17±0.23、2.15±0.20、1.58±0.11，ICAM-1蛋白表达水平分别为0.25±0.03、1.03±0.07、1.02±0.09、0.47±0.05。感染组、阴性组、干扰组细胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。干扰组细胞中ICAM-1 mRNA和蛋白水平均显著低于感染组和阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3各组支气管上皮细胞16HBE细胞凋亡率比较结果见图3。对照组、感染组、阴性组、干扰组细胞凋亡率分别为(7.62±0.71)%、(28.32±2.17)%、

(27.49±2.40)%、(14.38±1.22)%。感染组、阴性组、干扰组细胞凋亡率显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；干扰组细胞凋亡率显著低于感染组和阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)。

1：对照组；2：感染组；3：阴性组；4：干扰组。

图2各组支气管上皮细胞中ICAM-1蛋白表达(Westernblot)

Fig.2ExpressionofICAM-1proteinofbronchialepithelialcellsineachgroup(Westernblot)

图3流式细胞术检测各组支气管上皮细胞细胞凋亡情况

Fig.3Apoptosisofbronchialepithelialcellsineachgroupdetectedbyflowcytometry

2.4各组支气管上皮细胞16HBE培养基上清液中IL-1β、TNF-α水平比较对照组、感染组、阴性组、干扰组细胞培养基上清液中IL-1β水平分别为1.11±0.10、1.62±0.08、1.66±0.12、1.35±0.08，TNF-α水平分别为1.64±0.13、2.38±0.21、2.39±0.20、2.01±0.12。感染组、阴性组、干扰组细胞培养基上清液中IL-1β、TNF-α水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。干扰组细胞培养基上清液中IL-1β、TNF-α水平显著低于感染组和阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5各组支气管上皮细胞16HBE中CleavedCaspase-3、NF-κBp65蛋白水平比较结果见图4。对照组、感染组、阴性组、干扰组细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平分别为0.26±0.05、0.84±0.09、0.87±0.04、0.48±0.06，NF-κB p65蛋白水平分别为0.28±0.04、0.89±0.07、0.86±0.06、0.64±0.05。感染组、阴性组、干扰组细胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。干扰组细胞Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平显著低于感染组和阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)。

1：对照组；2：感染组；3：阴性组；4：干扰组。

图4各组支气管上皮细胞中CleavedCaspase-3、NF-κBp65蛋白表达(Westernblot)

Fig.4ExpressionofCleavedCaspase-3andNF-κBp65proteinbronchialepithelialcellsineachgroup(Westernblot)

3 讨论

支气管哮喘是一种呼吸道免疫炎症相关的疾病，其发生与肥大细胞、T淋巴细胞、呼吸道上皮细胞等多种细胞有关[11-12]。ICAM-1在内皮细胞、白细胞、上皮细胞等细胞中广泛表达，属于免疫球蛋白超家族，参与细胞的识别、信号转导、活化增殖与分化，以及细胞的伸展和转移、免疫应答、肿瘤转移等一系列重要的生理和病理过程[13]。正常情况下，ICAM-1表达水平较低，而在发生炎症反应时，多种细胞因子作用于上皮细胞，诱导ICAM-1表达，进一步引起炎性因子释放[14-15]。研究显示，大鼠敲除ICAM-1基因后，基因缺陷的大鼠呼吸道内炎症程度明显降低，提示抑制ICAM-1的表达可以降低哮喘呼吸道炎症细胞的浸润，减轻哮喘症状[16]。唐力琼等[17]研究表明，用RSV诱导大鼠发生哮喘后，大鼠肺组织中ICAM-1水平升高，使用咳喘宁治疗后，哮喘大鼠肺组织中ICAM-1水平下降。本研究收集了哮喘儿童支气管黏膜组织和非哮喘儿童支气管黏膜组织，用qRT-PCR和Western blot检测发现，ICAM-1在哮喘儿童支气管黏膜组织中的表达水平高于非哮喘儿童支气管黏膜组织，提示ICAM-1在哮喘儿童支气管黏膜组织中表达上调。

呼吸道上皮细胞能够将外界环境中的有害物质隔离，形成免疫屏障，也是机体对抗病毒等物质的机械屏障[18]。正常情况下，呼吸道上皮完整的组织结构可以保护微环境的稳定。当受到外界环境刺激后，呼吸道上皮细胞作为效应细胞合成黏附因子等多种细胞分子，参与免疫反应[19]。RSV感染后可诱导呼吸道上皮细胞发生损伤，破坏细胞骨架，导致呼吸道上皮组织完整性受到破坏，引起肺炎、支气管炎、哮喘等疾病的发生[20]。本研究结果显示，RSV感染后的支气管上皮细胞凋亡率增加，细胞培养基上清液中IL-1β、TNF-α水平也升高，而下调ICAM-1后，细胞凋亡率有所降低，细胞培养基上清液中 IL-1β、TNF-α水平下降，说明下调ICAM-1可以缓解RSV诱导的支气管上皮细胞损伤。

NF-κB与炎性因子、趋化因子等多种细胞因子的分泌有关，其在正常情况下以非活性形式存在于细胞质内，当细胞受到外界环境刺激后可以被激活进入到细胞核内，影响靶基因的转录，调控细胞的生长、凋亡等过程[21]。NF-κB p65是NF-κB发挥生物学活性所必需的亚单位[22]。研究显示，NF-κB p65在哮喘儿童肺组织中表达上调，在呼吸道上皮细胞中广泛表达[23]。Caspase-3参与支气管上皮细胞的凋亡过程，是Caspase凋亡级联反应中的凋亡执行子，其活化成为Cleaved Caspase-3后可以诱导细胞凋亡的发生[24-26]。本研究结果显示，RSV感染后的支气管上皮细胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65水平升高，而下调ICAM-1后，支气管上皮细胞经RSV感染，细胞中的Cleaved Caspase-3、NF-κB p65水平下降，提示下调ICAM-1可以通过降低Caspase-3活化水平抑制RSV诱导的支气管上皮细胞凋亡，其作用机制还可能与NF-κB p65有关。

综上所述，ICAM-1在哮喘儿童支气管黏膜组织中过度表达，参与哮喘的发生，在RSV诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎性因子分泌中具有重要作用，而其具体作用机制仍需进一步研究。本研究为今后研究哮喘的发病机制及靶向ICAM-1减少哮喘支气管上皮细胞损伤提供了理论基础。