不同棉花品种及施钾量对黄萎病抗性生理机制的影响

李岩，张希鹤，郁凯，霍钰阳，王友华,2，陈兵林,2*

（1.南京农业大学/农业农村部作物生理生态与生产管理重点实验室，南京210095；2.江苏省现代作物生产协同创新中心，南京210095）

黄萎病是为害棉花生长的土传病害，其中落叶型是棉花黄萎病中最严重的1种类型，在我国三大棉区呈蔓延趋势[1]。钾素能减轻植物真菌、细菌和病毒性病害[2]，因此研究落叶型黄萎病菌胁迫下钾素提高棉花黄萎病抗性的生理机制，对防治棉花黄萎病具有重要意义。

植物细胞次生壁加厚能在细胞形态结构上抵抗黄萎病菌的入侵，是棉株抗黄萎病菌的第一道屏障[3-4]。次生壁中含有大量的木质素[5-7]，其含量与棉花品种的耐病程度成正比[5,8]。组织结构抗性强的棉株，木质部紧实，间隙较小，细胞壁较厚[9-10]；导管内堆积的木质素也能阻止病原菌在植株体内的进一步扩散[11]。黄萎病侵染后，棉株体内会产生一系列的生理变化[2]，酚类物质作为莽草酸途径的中间产物，在棉花抗病防御反应中起重要作用[12]。酚类物质可降低马铃薯中大丽轮枝菌繁殖体的活力，起抑菌和杀菌作用[13]；它还能抑制真菌水解酶的合成和分泌，避免棉花木质部结构的分解和导管的堵塞[14]。也有研究表明，总酚含量与棉花黄萎病情呈显著的负相关[15]。苯丙烷代谢在木质素及酚类物质生成中起重要作用[3,16]，过氧化物酶（Peroxidase,POD）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase,PAL）是苯丙烷代谢的关键酶和限速酶[17-20]，其表达量和活性的提高能促进木质素含量及酚类等次生物质的生成[5,21]。钾素能促进植物形成物理障碍抵抗病原真菌[22]，能提升感禾谷镰刀菌的玉米茎秆和根中POD、PAL的活性，增加木质素诱导量，改善玉米的组织结构[6,22]。钾素有助于柠檬细胞壁的木质化和硅质化，抵抗流胶病原真菌的侵染[23-24]，也是影响酚类物质形成的重要因子，烟叶钾含量在2%～4%时，总酚、类黄酮含量随着烟叶钾含量的增加而增加[25]。现有研究多是关于钾肥对棉花抗病增产效果的阐述以及病原真菌胁迫后的施钾响应机制，而对钾素影响棉花黄萎病抗性机制鲜有报道。

棉花根部是黄萎病侵染点，叶部是病症显现部位，本研究拟通过施用不同的钾肥，探讨棉株钾素的吸收、根和叶中木质素和总酚含量,以及叶中PAL、POD活性的变化，阐述钾素影响棉花黄萎病抗性的生理机制，为棉花生产上制定抗黄萎病施肥策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2016－2017年在江苏省盐城市大丰区稻麦原种场（33°24′N,120°34′E）棉花黄萎病圃区进行，2016年黄萎病病圃区人工接种大丽轮枝菌[26-27]，落叶型大丽轮枝菌菌种V08DF1由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。2年试验地土壤情况见表1。

试验采用裂区设计，主处理为施钾量，设5个施钾水平：0、75、150、225、300 kg·hm－2（分别用K0、K75、K150、K225、K300表示）；副处理为品种，设3个品种：冀棉11号（JM-11，感病品种）[28]、中植棉2号（ZZM-2，抗病对照品种）[29]和农大601（ND-601，抗病品种）[30]，重复3次。小区长11 m，宽4.5 m，行距0.90 m，株距0.25 m，种植密度为44 460株·hm－2。钾肥（硫酸钾型肥料）在移栽期（2016年5月15日、2017年5月23日）、初花期（2016年7月10日、2017年7月17日）各施50%。纯氮用量为300 kg·hm－2，移栽期、初花期、盛花期（2016年7月31日、2017年8月6日）分别施30%、30%和40%；磷肥（P2O5）总量100 kg·hm－2，移栽时一次施用。其他管理措施同高产大田。

表1 试验地土壤基本情况Table 1 The organic matter and N&P&K contents of the soils at the experimental sites

1.2 取样方法

在黄萎病发生较为严重的铃期，在各小区选择生长均匀一致的健株和病株（病级[31]一致）各3株，将功能叶用去离子水擦拭干净后，剪去主脉及叶缘，用液氮速冻50 min后，放置于－80℃低温冰箱中保存，待测酶活性；其余部分按根、叶、茎枝、蕾、花、铃分解，于烘箱105℃下杀青30 min，80℃下烘干至质量恒定，粉碎后用于钾含量、木质素和总酚含量等的测定。

1.3 测定方法

1.3.1钾含量。采用H2SO4-H2O2消煮法[32-33]，用FP640型火焰光度计测定。

1.3.2根、叶中木质素含量。用硫代硫酸钠氧化还原滴定法[34-35]测定。

1.3.3总酚含量。参见宋凤鸣等[36]和韩卫娟等[37]测定总酚物质含量的方法，并略有改进：标准液采用没食子酸标准品0.2 g·L－1(HPLC≥98%)。取5 g研磨过筛（孔茎0.3 mm）后，用60%（体积分数）乙醇50 mL超声波萃取30 min，减压抽滤后定容100 mL，取50μL提取液和一系列标液（0.1、0.2、0.3、0.5、0.7 mL），加 入0.25 mol·L－1Folin-ciocalteu试剂2.5 mL静置3 min后，加10%Na2CO33 mL，去离子水定容至10 mL，25℃黑暗条件下处理1 h，用xMark型微孔板分光光度计（日本）在765 nm处测定吸收值。

1.3.4PAL和POD活性。用反式肉桂酸比色法测定棉叶PAL活性，用愈创木酚法测定棉叶POD活性[38]。

1.4 数据处理

施钾缓病效果＝（对照病情指数－施钾处理下的病情指数）/对照病情指数×100%；平均施钾缓病效果＝（无钾处理下的病情指数－∑施钾处理下的病情指数/4）/无钾处理下的病情指数×100%；根（叶）部钾含量变化幅度＝[（施钾处理根（叶）部钾含量－不施钾处理根（叶）部钾含量]/不施钾处理根（叶）部钾含量×100%。

采用Microsoft Excel 2016软件进行数据处理，SPSS 11.5软件进行方差分析、相关回归分析，Origin 9制图。

2 结果与分析

2.1 品种及施钾量对黄萎病的缓解效果

施钾能明显缓解棉花的黄萎病情（表2），2年分别达显著（2017年）或极显著水平（2016年），黄萎病缓解效果与施钾量间的关系可用抛物线方程模拟。从2年平均值来看，JM-11、ZZM-2、ND-601施钾最大缓病效果分别为32.5%、26.4%、16.5%，抗黄萎病性越差的品种，施钾后病害缓解效果越明显。另外，3个品种缓病效果最大时对应的平均施钾量分别为290.5 kg·hm－2、253.5 kg·hm－2、229.5 kg·hm－2。

表2 不同品种及施钾量缓解棉花黄萎病情效果Table 2 Effects of different varieties and amount potassium applications on cotton Verticillium wilt

2.2 施钾量对病株根和叶钾含量的影响

相对于不施钾处理，施钾能明显增加铃期棉花根和叶钾含量（表3）。JM-11根和叶中钾含量随着施钾量的增加呈增加的趋势（除2016年该品种K75根中钾含量高于K150，K150处理叶中钾含量高于K225），且在K300处理下棉花根和叶部钾含量最大；而ZZM-2和ND-601呈现出先增加后降低的趋势，在K225处理下钾含量最高。

2.3 品种及施钾量对棉花木质素含量的影响

黄萎病显著降低铃期棉花根部木质素的含量（图1-A），JM-11、ZZM-2和ND-601病株较健株根部木质素含量2年均值分别下降22.0%、11.7%、16.3%。黄萎病也显著降低JM-11棉叶中木质素的含量，2年均值下降14.7%，但对ZZM-2和ND-601棉叶中木质素含量影响不显著（图1-B）。抗黄萎病性强的品种（ZZM-2和ND-601）健株及病株根、叶中木质素含量整体要高于抗性较弱的品种（JM-11）。

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表3 铃期棉花黄萎病株根和叶中钾含量的变化%Table 3 Changes of potassium content of disease roots and leaves of cotton during boll stage

图1 黄萎病对棉花铃期根（A）、叶（B）中木质素含量（以干物质质量计）的影响Fig.1 Effect of Verticillium wilt on lignin content in dried roots and leaves of cotton during boll stage

相同施钾量下，随着品种的抗黄萎病性增强，病株棉花根、叶中木质素含量呈升高的趋势，棉根中的木质素含量明显高于棉叶。

从病株木质素2年均值来看，随着施钾量的增加，JM-11病株根、叶中木质素含量均呈增加的趋势；而ZZM-2根、棉中木质素含量呈先增加再下降的趋势，K225处理木质素含量最高，但K150、K225、K300处理间差异较小；随着施钾量的增加，ND-601根、叶中木质素含量呈先增加后下降的趋势，当施钾量达150 kg·hm－2时，根、叶中木质素含量最高，但K150、K225、K300处理间棉根中木质素含量差异较小，棉叶中差异极小（图2）。

图2 不同施钾量对棉花铃期病株根（A）、叶（B）中木质素含量（以干物质质量计）的影响Fig.2 Effect of potassium fertilizer on lignin content in dried roots and leaves of disease cotton during boll stage

综合2年数据，病株根、叶中木质素含量均随根、叶中钾含量的增加有增加的趋势（图3），且与钾含量呈极显著线性关系（棉根：R2＝0.539 5～0.884 8**；棉叶：R2＝0.564 3**～0.940 2**）。从木质素含量增加速率（即拟合方程的斜率）来看，ZZM-2最高，JM-11居中，ND-601最低；从同一品种根、叶木质素增长速率2年均值的比值来看，JM-11为3.21，ZZM-2为2.71，ND-601为2.12，显然抗病品种ND-601根、叶中木质素增加比较协调，感病品种JM-11根中木质素增加速率明显大于棉叶。

2.4 品种及施钾量对棉株总酚含量的影响

从不同施钾量处理下棉株根和叶木质素平均含量来看，黄萎病发生后，棉株根、叶中总酚含量均低于健株（图4）。随着品种抗黄萎病性的增强，棉株根、叶中总酚含量下降幅度较小，以JM-11根、叶中总酚含量下降幅度最大，2年平均分别达54.4%、31.3%；ND-601下降幅度最小，2年分别下降34.6%、20.3%。抗黄萎病性强的品种根、叶中总酚含量均高于抗性较弱的品种。

图3 棉花病株根（A）、叶（B）钾含量与根、叶中木质素含量（以干物质质量计）的相关分析Fig.3 Relationship between lignin content and leaf potassium content in dried roots and leaves,respectively

图4 棉花铃期根（A）、叶（B）中总酚含量（以干物质质量计）Fig.4 Effect of Verticillium wilt on total phenol content in dried roots and leaves of cotton during boll stage

在相同施钾量下，随着品种的抗黄萎病性增加，病株棉花根、叶中总酚含量皆呈明显升高趋势（图5）。

从病株总酚含量2年均值来看，JM-11的K0处理棉根中的总酚含量明显低于施钾处理，且K75、K150、K225、K300施钾处理间差异较小；棉叶中的总酚含量随施钾量的增加呈增加的趋势。对ZZM-2来说，棉根、棉叶中总酚含量随施钾量的增加呈增加的趋势，K0与各施钾处理棉根中总酚含量差异不大，棉叶中以K225处理最大，且K225与K300差异较小。ND-601的根、棉叶中总酚量随施钾量的增加呈先增加再下降的趋势，以K225最大，K300次之。

图5 不同施钾量下棉花铃期黄萎病株根（A）、叶（B）中的总酚含量（以干物质质量计）Fig.5 Effect of potassium fertilizer on total phenol content in dried roots and leaves of disease cotton during boll stage

病株根、叶中总酚含量分别与根钾、叶钾含量呈显著或极显著线性正相关（图6）。从总酚含量增加速率（即拟合方程的斜率）来看，随着根钾、叶钾含量的增加，病株根、叶中总酚含量以JM-11增加最快，其次根部为ZZM-2，叶部为ND-601。

2.5 品种及施钾量对棉株PAL和POD活性的影响

从图7看出，黄萎病显著影响JM-11功能叶中PAL和POD活性，且影响程度大于ZZM-2和ND-601，2种酶活性病株较健株2年平均分别低17.8%、29.5%。ZZM-2、ND-601的PAL活性下降达显著水平（2016年）或影响较小（2017年）。ZZM-2、ND-601的功能叶POD活性分别下降26.0%、23.0%。

由图8中可知，在相同施钾量下，随着品种的抗黄萎病性增强，病株功能叶中PAL、POD活性呈明显升高的趋势。综合2年试验结果，3个品种功能叶中PAL活性均随着施钾量的增加呈增加的 趋势，JM-11的K225、K300处理间 差 异较小，变幅为24.18～24.23 U·g－1·min－1，ZZM-2、ND-601的K75、K150、K225、K300处 理 间 差 异均较小，变幅分别为27.45～27.88 U·g－1·min－1和29.75～30.38 U·g－1·min－1（图8-A）。

图6 棉株根（A）、叶（B）钾浓度与根、叶中总酚含量（干物质质量）的相关分析Fig.6 Relationship between total phenol content and leaf potassium content in dried roots and leaves,respectively

图7 棉花铃期功能叶中PAL（A）及POD（B）的活性Fig.7 Effect of Verticillium wilt on PAL and POD activity in functional leaves of cotton during boll stage

图8 不同施钾量下棉花铃期黄萎病病株功能叶PAL（A）及POD（B）的活性（以鲜物质质量计）Fig.8 Effect of potassium fertilizer on PAL and POD activity in fresh functional leaves of disease cotton during boll stage

从POD活性2年平均值来看，3个品种POD活性随施钾量的增加呈先上升再下降的趋势，JM-11、ZZM-2的POD活性以K225最高，其次分别为K300、K150处理，ND-601的POD活 性 以K150处理最高，其次为K225处理（图8-B）。

相关分析表明，病株功能叶PAL、POD活性与叶钾含量呈显著正相关（图9）。从酶活性增加速率（即拟合方程的斜率）来看，随着叶钾含量的增加，PAL活性增加速率随品种抗黄萎病性的减弱而增加，即JM-11的PAL活性增加速率最快，其次 为ZZM-2，ZZM-2、ND-601品 种 的PAL增长速度的差异较小。POD活性增加速率以JM-11最快，其次为ND-601，ZZM-2的POD活性增加速率显著低于JM-11和ND-601。

2.6 影响棉花抗黄萎病性的关键物质和酶的相关性

棉根钾含量与病情指数呈显著或极显著的负相关（表4），JM-11、ZZM-2叶钾含量与病情指数显著和极显著负相关，ND-601叶钾含量与病情指数呈负相关，但不显著。JM-11病情指数与棉根、棉叶中木质素、总酚含量，棉叶中PAL活性均呈显著负相关；ZZM-2和ND-601病情指数与棉根、棉叶中总酚含量均呈显著负相关。

3 讨论

3.1 品种的抗性与棉花黄萎病的发生

前人研究表明，酚类物质含量越高、PAL和POD活性越强，棉花抗黄萎病性越强[39-42]。黄萎病会使棉花病株产生过敏反应和系统性获得性抗性，抗病性强的棉株诱导产生酚类物质和PAL、POD时间短，持续时间较长，酚类物质最终含量及PAL、POD活性高于感病品种[43]；玉米茎腐病的抗病品种木质素诱导量及PAL活性也高于感病品种[6]。

图9 黄萎病株功能叶钾含量与叶中PAL（A）、POD（B）活性的量化关系Fig.9 Relationship between PAL and POD activity and leaf potassium content,respectively

表4 铃期不同品种棉花黄萎病情与发病棉株钾浓度、抗病相关物质含量及酶活性的相关系数Table 4 The correlation coefficients between Verticillium wilt of different varieties cotton and lignin,total phenols content and PAL,POD activity during boll period stage

本研究表明，黄萎病对感病品种（JM-11）根和叶中木质素、总酚含量及功能叶中PAL、POD活性影响最大，对抗病对照（ZZM-2）影响较大，对抗病品种（ND-601）影响较小，说明抗黄萎病性越差的品种，抗病防御体系受黄萎病破坏越大（图1、图4、图7）。本研究还发现，感病品种JM-11根和叶中木质素、总酚含量及功能叶中PAL活性在抗黄萎病体系中发挥重要作用，抗病品种（ZZM-2和ND-601）根和叶中总酚含量是影响黄萎病情的关键物质（表3）。

3.2 钾肥影响棉花黄萎病的抗性

对玉米茎腐病研究表明，钾素增加了茎基部木质素的诱导量，提高了茎基部PAL、POD的活性，并且能保持较高的水平[6,22]。钾素提高了柠檬木质素含量，促进细胞壁的木质化及硅质化[23-24]。Amtmann等[2]研究表明，缺钾植株通过诱导茉莉酸途径提高了拟南芥抗生物病害相关物质的合成。

本研究中，施钾处理提高了棉花根和叶中木质素、总酚含量及功能叶中PAL、POD活性，增强了棉花抗黄萎病性。不同施钾量对ZZM-2、ND-601的最大缓病效果分别为21.7%、13.4%，均弱于JM-11（25.2%）。ZZM-2的缓病效果好于ND-601（表2）。究其原因，是由于棉花根和叶部钾含量与不同品种对钾含量敏感性差异的共同影响。施钾后，虽然ZZM-2、ND-601根和叶钾含量增幅有高于JM-11的情况，但JM-11根钾含量的敏感性强于ND-601，弱于ZZM-2（图3），叶钾含量的敏感性强于抗病品种ZZM-2、ND-601（图6、图9）。因此，施钾对感病品种JM-11缓病效果强于抗病品种（表2）。抗病品种根和叶中总酚对根叶钾含量的响应弱于感病品种（图6），根和叶中的总酚含量增幅均较小，从而导致了抗病品种尤其是ND-601施钾缓病效果较差。2年的数据（表3）显示，感病品种JM-11根、叶钾含量随着施钾量的增加而增加，而抗病品种根和叶钾含量在施钾量为225 kg·hm－2（其中2017年ND-601根部钾含量在施钾量为150 kg·hm－2）时最大。

氮钾配合施用对陆地棉产量影响表明，N与K2O施用质量比为1.15时棉花产量最高[44]。也有学者认为，该比值为1.63时，氮钾配施既促进了棉花生长发育，又可使棉花产量及品质较大幅度提升[45]。在施氮总量300 kg·hm－2条件下，以前述氮钾配施的研究结果为依据，应施用K2O 184～261 kg·hm－2。在本研究中，2年数据显示：感病品种JM-11、抗病对照ZZM-2、抗病品种ND-601基于病情指数最优施钾量分别为290.5 kg·hm－2、253.5 kg·hm－2、229.5 kg·hm－2。可见，感病品种JM-11的最优施钾量超出常规施钾量，即棉花在重病田的生物逆境中需要较多的施钾量，且随着棉花品种黄萎病抗性的减弱应适当增施钾肥。

4 结论

抗黄萎病性弱的品种，抗病防御体系易受破坏，感病品种（JM-11）抗黄萎病相关物质含量和酶活性受病情的影响较抗病品种（ZZM-2和ND-601）大。根叶中木质素、总酚及棉叶PAL是感病品种抗黄萎病体系中发挥重要作用的物质，抗病品种中仅根、叶中的总酚为抗黄萎病的重要物质。感病品种对叶片中钾含量的敏感性强于抗病品种，且随着施钾量的增加，感病品种病株根、叶中木质素、总酚含量及功能叶中PAL、POD活性下降幅度大于抗病品种。JM-11、ZZM-2和ND-601对应黄萎病最大缓解效果的施钾量分别为290.5、253.5、229.5 kg·hm－2。