棉花导入系耐盐性鉴定及耐盐基因QTL定位

朱协飞，司占峰

（南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京210095）

我国盐碱地面积达2.7×107hm2，盐胁迫已成为限制土地生产力的主要因素之一[1]。随着耕地面积的减少，棉花种植区域逐渐向盐碱地集中，选用耐盐品种是提高盐碱棉田棉花产量的重要措施[2]。棉花是盐碱地种植的先锋作物[3]。棉籽在较高NaCl浓度下仍然能发芽[4]，但一般来讲，当土壤含盐量0.2%～0.3%时出苗困难，0.4%～0.5%时种子不能出土，大于0.65%时很难发芽[5]。NaCl主要影响种子吸水膨胀，造成萌发慢，萌发率低，盐浓度越大，这种渗透胁迫越严重。出苗后，棉花从异养向自养过渡，此时盐分胁迫引起幼苗畸形，子叶难展平，严重时叶绿素合成受阻、棉苗黄化。二、三叶期的棉苗体内已开始花芽分化，此时对盐分最为敏感。盐胁迫下，棉花叶片发软、色暗、功能期短，脱落早，侧根发生少、发生区黄褐色，干物质积累减少，生长停滞，甚至死苗。随着盐胁迫时间加长或强度加大，幼苗株高、叶面积、绿叶数、侧根数等指标的减少量也越大。从干物质积累的根冠比来看，大多引起根冠比变大[6]，说明棉苗地上部所受伤害更大。刘国强等[7]对棉花4个栽培种4 078份品种资源的耐盐性进行苗期鉴定表明，栽培种之间的耐盐性差异很大，并且棉花的总体耐盐性较差。李函利等[8]对179份来源不同的低酚棉种质资源的耐盐性进行鉴定，没有发现高抗材料，抗盐材料占鉴定材料的2.2%、耐盐材料占30.2%、盐敏感材料占67.6%等。在棉花种质资源的耐盐性鉴定指标方面，叶武威等[9]采用芽长和芽质量作为耐盐鉴定指标，孙小芳等[10]采用相对出苗率、苗期对株高、相对叶面积作为耐盐鉴定指标，沈法富等[11]采用棉花叶片总面积和叶片鲜物质质量减少的分数作为耐盐鉴定指标。本研究采用NaCl处理后植株鲜物质质量增加量的变化为鉴定指标，以检测各个导入系材料对NaCl处理的反应。

近年来，人们利用回交，结合分子标记辅助选择技术，构建了大规模染色体片段导入系（Chromosomal segment introgression lines，CSIL），并且在水稻、玉米、小麦、棉花等作物育种实践中取得了重要进展[12-24]。但对染色体片段导入系耐盐性状的遗传研究报道很少。王鹏等[20-21]利用陆地棉TM-1与海岛棉7124为亲本培育了海岛棉染色体片段导入系，该套导入系共有174个家系，包含298个染色体片段，导入片段总长度2 329.2 cM，覆盖长度1 433.6 cM，覆盖了棉花基因组81.3%。利用该导入系精细定位了与品质性状、产量性状相关的QTLs（Quantitative trait loci），为染色体片段导入系在育种中的应奠定了基础[21]。本文选取了王鹏等[20-21]培育的海岛棉染色体片段导入系的148个家系进行耐盐性鉴定，并对耐盐相关QTL进行定位，以期明确这类导入系种质资源的耐盐性水平，筛选耐盐性好的种质资源，为耐盐育种和耐盐基础研究提供重要的资源材料和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为本课题组利用海岛棉7124（提供染色体片段）与陆地棉TM-1培育的148份染色体片段导入系，分别命名为CSIL001～CSIL148。以导入系供体亲本海岛棉7124与轮回亲本陆地棉TM-1作为对照品种（表1）。

1.2 试验方法

1.2.1材料种植与试验设计。试验于2016年5～6月在安徽省当涂县南京农业大学皖江基地进行。经硫酸脱绒后，每份材料中各挑选72粒饱满一致的种子，采用穴盘育苗方式播种。穴盘规格：12孔/行×6行，育苗塞高度7 cm，播种面4 cm×4 cm。每穴盘播种2个材料，每个材料播种3行，设为3个重复，留苗36株，处理前后选择27株较均匀一致的苗分别称取质量统计。

棉花耐盐性鉴定采用NaCl胁迫法[3]。因此本研究以NaCl处理来检测导入系耐盐性，并计算盐害系数。

试验设置3个处理。处理1：5月10日播种，6月1日称鲜物质质量。处理2：5月10日播种，6月1日托盘中加水2.2升（加满整个托盘），6月10日称鲜物质质量。处理3：5月10日播种，6月1日托盘中加入与处理2等量的25 g·L－1NaCl溶液，6月10日称取鲜物质质量。

1.2.2盐处理与盐害统计方法。盐浓度确定：在多次试验基础上，将NaCl质量浓度确定为25 g·L－1。

盐害系数计算参照张国伟的方法[2]。即：盐害系数＝（对照值－处理值）/对照值×100%。本试验对照值、处理值分别采用相对生长量值。即：对照值＝处理2－处理1，处理值＝处理3－处理1。

1.2.3QTL定位方法。结合已有导入系的分子鉴定数据[21]，利用QTL IciMapping 4.0软件进行耐盐性状QTL定位，以LOD≥2.5作为阈值分别来判断具有加性效应的QTL是否存在，并分析其特征。

2 结果与分析

2.1 148个导入系及2个亲本3个处理的植株鲜物质质量统计及盐害系数计算

6月10日观察，与处理2相比，处理3多数材料表现出明显的盐害症状（图1）。

表1列出了148个导入系及2个亲本3个处理的植株鲜物质质量及盐害系数。由于部分材料高度感盐，处理3盐胁迫10 d后，其鲜物质质量反而低于处理1，导致盐害系数大于100%，表中均以100%列出。从表1可以看出，供体亲本海7124、受体亲本TM-1的盐害系数分别为29.35 %、71.70%。148个导入系的耐盐性差异较大，盐害系数为1.34%～100%，平均盐害系数为61.22%，介于两个亲本之间，表明导入的染色体片段长度及位置差异会导致导入系的耐盐性差异，甚至会降低导入系的耐盐水平。

表1 导入系鲜物质质量及盐害系数Table 1 Fresh weight of Introgression lines and their salt damage coefficients

表1 （续）Table 1(continued)

图1 部分材料生长情况比较Fig.1 Seedlings comparison under different treatments

以两个亲本的盐害系数为界线，把148个导入系的盐害系数分成3组，盐害系数在0～29.35%的导入系有35个，占23.65%；盐害系数29.35%～71.70%的有58个，占39.19%；盐害系数71.70%～100%的有55个，占37.16%。表明有37.16%的导入系耐盐性降低，但62.82%的导入系耐盐性有所提高，23.65%的导入系耐盐性优于两个亲本。说明从陆地棉背景的海岛棉染色体片段导入系中进行耐盐材料筛选是可行的。

2.2 导入系耐盐性状的QTL定位

利 用QTL IciMapping 4.0（http://www.isbreeding.net）检测CSIL群体中耐盐性状QTL所产生的加性效应，以LOD≥2.5作为阈值分别来判断具有加性效应的QTL是否存在，结果见表2。

共检测到23个耐盐相关的QTLs，分布在9条染色体上，其中11个QTL加性效应表现为正值，贡献率在1.18%～2.29%之间，表明NaCl处理严重影响了植株的生长；12个QTL加性效应表现为负值，贡献率在1.11%～3.18%之间，表明NaCl处理对其影响较小，对应的染色体片段含有耐NaCl基因，可在改良棉花抗盐性上加以利用。我们还发现，耐盐相关QTLs呈现染色体聚集分布，其中A02、A03、D01、D02和D07上都至少有2个不耐盐的QTL，而A05、A12、D05和D11上都至少有2个耐盐的QTL，其他染色体未检测出耐盐相关的QTL。尤其是A5和D5两条染色体共检测出7个耐盐相关QTL，因此在抗逆育种中针对特定染色体的选择能大大提高选择效率。

表2 耐盐性状QTL定位Table 2 Mapping of QTLs for salt tolerance-related traits

3 讨论

一般认为，棉花幼苗苗龄小，苗体嫩，但体内已开始花芽分化，对盐分胁迫比较敏感，极易遭受土壤中盐分毒害而导致生育缓慢甚至死苗[7,25]。因此在棉花耐盐性鉴定时，盐浓度的高低将对试验结果产生重要影响，甚至决定试验成败。Levittd等认为棉花生长的极限盐度为0.6%～0.7%[26]。由于试验方法不同，本研究参考前人研究成果，并在多次试验基础上，将盐质量浓度确定为25 g·L－1，试验结果良好。

对于棉花耐盐性鉴定方法，前人多采用双层滤纸法研究棉花萌发出苗期的耐盐性[27-28]，但棉花种子上带有一定的真菌，这些真菌在滤纸上容易感染，增加了试验误差。本试验采用穴盘育苗方式播种，与大田生产育苗方法一致。对苗期植株相对生长量进行耐盐性鉴定，方法简单、直观，实际操作更接近大田生产。

目前耐盐性状的QTL定位已普遍用于水稻、玉米等作物的分子育种研究[29-31]，在棉花中研究报道较少。郭纪坤[32]利用（鲁棉97-8×苏12）F2分离群体，检测到4个与抗盐相关的QTL位点，贡献率为5.47%～17.20%。George Oluoch[33]利用陆地棉品种中棉所12和野生棉毛棉的种间杂交F2:3家系进行耐盐性QTL定位，共有11个QTL在至少两个环境中被定位到，分布于8条染色体（A09、A11、D01、D07、D08、D09、D11和D12染色体），在两种环境下单个位点分别解释了11.97%和18.44%的表型变异，其中D11染色体检测到的位点与本研究中检测到的位于相近的位置。将陆地棉背景的海岛棉染色体片断导入系作为研究对象进行耐盐性状的QTL定位未见报道，因此，本研究在棉花耐盐基因资源挖掘有一定的创新意义。

4 结论

本研究以148份陆地棉背景的海岛棉染色体片断导入系为研究对象，利用苗期植株相对生长量进行耐盐性鉴定，发现导入系耐盐性差异较大，总体耐盐水平较高，有35个材料的盐害系数在0～29.35%之间。进一步进行耐盐性状的QTL定位，检测到了23个盐害相关的QTL，其中12个抗盐QTL，聚集分布在A05、A12、D05和D11染色体上，有一个QTL与前人研究检测到的QTL位于相近的位置。因此，这些导入系中的部分材料可以作为耐盐资源，进行耐盐育种及相关研究，对特定染色体的筛选会具有更高的效率。