超高效液相-串联质谱测定鸡蛋17种兽药残留的方法

李明 张振宇

（河南省济源市畜产品质量监测检验中心459000）

为防治各类疾病、降低死亡率，兽药广泛应用于蛋鸡养殖，但由于兽药滥用、误用及不遵守休药期规定，导致鸡蛋中有药物残留，这些药物通过食物链在人体内蓄积，产生耐药性，还可致基因突变、致畸、致癌。

检测兽药残留的方法较多，常见的主要有液相色谱法[1-2]、气相色谱质谱法[3]、液相色谱-串联质谱法[4-5]、酶联免疫法[6]等。根据鸡蛋市场流通快的特点，需建立短时间内、高通量、一次性准确测定鸡蛋中兽药多残留。为此本项目开展鸡蛋兽药多残留检测技术的研究，通过对样品处理、色谱、柱谱条件的优化等建立了样品一次性处理、同时测定3大类17种兽药残留的超高效液相-串联质谱方法。相比现有方法具有更高的效率、更简单的前处理过程，且各项性能满足残留分析要求。

1 实验部分

1.1 仪器

UPLC Xevo TQ MS超高效液相色谱-质谱联用仪(Waters公司)；MS 3 basic漩涡混合器（IKA公司）；高速冷冻离心机(香港力康公司)；TTL-DCII型氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）。

1.2 试剂与材料

乙腈、甲醇为色谱纯；甲酸为优级纯；17种抗生素标准品全部购于阿尔塔科技有限公司，标准液浓度为100μg/ml。6个同位素内标分别为氯霉素-D5、甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3；恩诺沙星-D5、达氟沙星-D3；磺胺间二甲氧嘧啶-D6；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（Waters公司，60mg/3ml）。

1.3 色谱条件

色谱柱：CORTECS UPLC C18 Column，（1.6μm，2.1mm X 100mm）；流动相A为乙腈；流动相B为0.2%甲酸水梯度洗脱；流速为0.4ml/min；柱温为40℃；进样量为10μL。

1.4 质谱条件

电离方式：除酰胺醇类采用电喷雾负离子模式，其他均为电喷雾正离子模式；多反应监测模式（MRM）采集；毛细管电压2.7kV离子源温度为150℃；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流量为1000L/h。

1.5 样品处理

称取样品2.00g，置于50ml离心管内，加适量内标液，再加无水硫酸钠4g，最后加入0.2%甲酸乙腈10ml，涡旋0.5min后震荡提取15min。12000r/min离心5min，取5ml上清液，过Oasis PRiME HLB柱，用3ml0.2%甲酸乙腈过柱，收集全部流出液，于50℃下用温和氮气吹至近干。并用1ml 10%乙腈溶解，涡旋过0.22μm滤头后供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理优化

2.1.1 样品提取

试验采用0.2%甲酸、1%甲酸和2%甲酸3种不同比例酸化乙腈结合的方式沉淀蛋白并提取目标物，使用无水硫酸钠除去样品和提取液中的水分。同时比较了乙腈和样品比例为3∶1、4∶1和5∶1分别提取。试验表明，采取2%甲酸乙腈和样品比例为5∶1的蛋白质沉淀效果最好，但在此条件下对磺胺类回收率较低，这是由于在酸性较强时，磺胺类碱性化合物的离子化程度增大，导致在有机相中的溶解性减弱。用0.2%甲酸乙腈、5∶1比提取并沉淀蛋白的条件，其回收率可大幅提高（回收率在60%以上）。所以，本试验选用该条件进行样品提取。

2.1.2 样品净化

由于鸡蛋中存在大量磷脂、脂肪等亲脂性杂质，极大干扰目标化合物的分析，同时降低色谱柱寿命。如果采用专一性较强的萃取小柱对测定某种或某类化合物效果较好，往往对其他组分回收率较差，不能满足3大类性质差异较大的17种兽药残留测定。

本研究采用Oasis MCX、Oasis HLB、Oasis PRiME HLB 3种固相萃取小柱进行样品净化处理比较。Oasis MCX和Oasis HLB萃取小柱要求大比例水相的上样才会使目标化合物在柱子上保留，这就要求把提取液中的乙腈置换成水相，而且各待测物在不同pH下的固相萃取柱上保留差异较大。而Oasis PRiME HLB萃取小柱可以用乙腈的提取液直接过柱，将磷脂及非极性干扰物吸附于固相萃取柱中，对所有待测物无吸附，这样既能有效去除干扰物，又确保了所有待测组分无损失，同时在净化过程中也省去了溶剂的转换过程，简化操作步骤。本实验采用Oasis PRiME HLB萃取小柱进行样品净化。

2.2 仪器条件的优化

2.2.1 色谱柱及流动相的选择

本方法选取CORTECS UPLC C18柱2.1mm×100mm，1.6μm，Waters BEH C18柱2.1×100，1.7μm，和HSS T3 2.1×100，1.8μm 3种色谱柱进行分离实验。本研究选择了3大类17种兽药。本实验通过色谱柱的选择与流动相优化达到此目的。根据各色谱柱的特点分别对流动相进行了优化试验。经试验，上述3种化合物在CORTECS UPLC C18的分离优于HSS T3色谱柱、BEH C18色谱柱。本试验采用该色谱柱进行测定，经优化其色谱梯度洗脱程序见表1（流动相A为乙腈、流动相B为0.2%甲酸水）。

2.2.2 质谱条件的优化

除酰胺醇类采用负离子模式，其他均为正离子模式，分别对锥孔电压、碰撞能量和选择离子进行充分优化，并确定其最佳锥孔电压和碰撞能量的电压值。对上述质谱条件优化后，可满足测定鸡蛋中兽残各组分定性、定量的要求。定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。

2.3 方法学验证

2.3.1 基质标准曲线与检出限

为降低基质效应影响，保证检测结果可靠准确，采用基质标准进行定量，采用不含待测物的鸡蛋空白基质溶液配制质量浓度，喹诺酮类、磺胺类为0.5，1，5，10，20，50ng/ml，酰胺醇类为0.1，0.2，0.5，2，5，10ng/ml一系列标准溶液，以标样峰面积/内标峰面积比值与质量浓度做标准曲线，得到相应线性回归方程。结果表明，在此质量浓度范围内所有组分线性良好，相关系数r均在0.993～0.999。以3倍信噪比计算得到的检出限在0.1～10μg/kg内，可满足鸡蛋中相应兽药残留测定的要求。

表1 色谱梯度洗脱程序

表2 酰胺醇类、喹诺酮类、磺胺类及内标定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞能量

2.3.2 回收率、精密度

根据实际检出能力制备了1.0，5.0，10.0μg/kg 3个质量分数的阳性鸡蛋样品，每个水平5平行试验，3个水平样品的回收率在61.8%～117%，RSD在1.2%～9.7%。方法的准确性和重复性良好。

3 结论

本文建立了无水硫酸钠除水、0.2%甲酸乙腈溶液一次性提取及Oasis PRiME HLB固相萃取超高效液相色谱-三重四级杆质谱联同时测定鸡蛋中酰胺醇类、喹诺酮类、磺胺类17种兽药残留方法。该法与现行国家标准、行业标准相比在保证准确性好、灵敏度高的同时，前处理方法更简单快速，为鸡蛋同时测定多种兽药残留的研究提供了数据和基础。