山奈酚对大鼠心肌细胞H9c2凋亡的影响

赵小双,杨海波,赵荫涛,刘 源

郑州大学第一附属医院心血管内科 郑州 450052

心室重构是引起心力衰竭的主要机制之一，贯穿整个心力衰竭的发展。在心室重构的演化过程中，心肌细胞中TLR4/NF-κB信号通路被激活并转录入核，诱导相关的下游炎症因子(IL-6、IL-1等)的转录及翻译，进而加速心肌细胞凋亡、间质纤维化。而细胞凋亡在心室重构晚期发挥着不可或缺的角色，极大地促进心室重构的发生及发展，因此抑制细胞凋亡可有效地逆转心室重构的进展[1]。但目前临床尚无特异性抑制心肌细胞凋亡的靶向药物，因此寻找可有效地逆转心室重构的靶向药物显得尤为重要。山奈酚归属于黄酮类化合物，主要存在于姜科植物山奈的根茎，也可见于各种水果、蔬菜中。有研究[2-3]结果提示，其具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用。还有研究[4]结果显示，山奈酚具有抗心肌细胞肥大及间质纤维化的作用，但其对心肌细胞凋亡的作用尚不明确。因此本研究就山奈酚对心肌细胞凋亡的作用做进一步的探讨，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料与仪器山奈酚购于上海融禾医药科技发展有限公司(货号520-18-3，分子式C15H10O6，纯度>99.9%，检测途径为高效液相色谱法)。取7.16 mg山奈酚溶解于1 mL DMSO中配制成实验所用的母液(25 mmol/L)，实验过程中DMSO在培养液中的体积分数低于0.02%。DMEM基础培养基、新生小牛血清、双抗(PS)、CCK-8试剂盒均购自日本同仁化学研究所，胰蛋白酶购自Gibco公司， DAPI购自ThermoFisher公司，抗体购自Cell Signaling Technology公司，LPS购自Sigma公司。恒温培养箱购自日本Sanyo公司，DP72倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，多功能微孔板检测系统Synergy HT购自美国BioTek公司。

1.2细胞培养大鼠H9c2细胞购自中科院上海细胞库。培养细胞所用的培养基成分为：DMEM基础培养基+体积分数10%小牛血清+体积分数1% PS。细胞培养于37 ℃恒温、体积分数为5%的CO2培养箱中，当细胞铺满80%的培养皿底(密度2×105个/mL)时，采用2.5 g/L胰蛋白酶消化后进行传代。在对细胞进行处理之前，将培养细胞所用的基础培养基更换为无血清培养基(DMEM基础培养基+体积分数0.5% PS)，接着饥饿处理18 h，饥饿处理可减少血清对刺激因素的影响，同时可使所有细胞处于同步化。

1.3细胞活性检测采用CCK-8法进行检测。实验分为2组：山奈酚组(0、5、25、50 μmol/L山奈酚处理组)和LPS+山奈酚组(10 mg/L LPS+0、5、25、50 μmol/L山奈酚处理组)，另设只加培养基和CCK-8溶液的空白对照、只加细胞和CCK-8溶液的阴性对照。首先将细胞接种到96孔板中，为提高实验准确性需保证每孔100 μL，且密度约维持在2×105个/mL，然后置于温箱连续培养24 h，再用无血清培养基替换原有培养基，进行18 h的饥饿处置，最后采用不同浓度山奈酚和(或)LPS处理12 h，将96孔板中的培养基再次换为含有10 μL CCK-8的无血清培养基100 μL，在恒温箱中继续孵育2.0～2.5 h后，将其置于酶标仪下(波长450 nm)分别检测每孔的吸光度(A)值，计算细胞活力，细胞活力=[(药物组A值-空白对照A值)/(阴性对照A值-空白对照A值)]×100%，绘制曲线。实验重复3次。

1.4细胞凋亡的检测实验分为3组：对照、单加10 mg/L LPS和10 mg/L LPS+50 μmol/L山奈酚。培养细胞在胰蛋白酶消化后调整密度为1×105个/mL，制作细胞爬行片，并进行饥饿培养18 h，后加入不同浓度山奈酚和(或)LPS处理细胞12 h，用PBS漂洗3次，再用10 g/L多聚甲醛进行固定10 min，接着用体积比2∶1乙醇/乙酸混合液在-20 ℃恒温下固定5 min，再次用PBS清洗3 min。加入平衡液室温下孵育10 s后滴加TdT酶工作液，37 ℃孵育1 h。加入工作液振荡15 s后孵育10 min，PBS洗3次，吸干液体，滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液，进行避光孵育约30 min，PBS再洗3次，DAPI封片，荧光显微镜下观察并拍照。正常的细胞核可被染为蓝色，而凋亡的细胞核则被染为绿色，每组选择8个视野(×400)，记录凋亡细胞数，计算细胞凋亡率。实验重复8次，取其平均值。

1.5Westernblot检测H9c2细胞凋亡相关蛋白及TLR4/NF-κB信号通路蛋白的表达实验分为5组：对照、单加10 mg/L LPS、10 mg/L LPS+5 μmol/L山奈酚、10 mg/L LPS+25 μmol/L山奈酚、10 mg/L LPS+50 μmol/L山奈酚。在冰上裂解细胞10 min，然后将其置于1.5 mL离心管中，超声裂解仪5 kHz进行10～15 s的裂解，4 ℃ 12 000×g离心15 min，上清液移至离心管中，BCA定量检测蛋白浓度并加入相同质量的蛋白于200 mL EP中进行高温变性。在每组样本混合均匀后取10 μL进行SDS-PAGE凝胶电泳，将GAPDH设置为内参，然后依据各样本的光密度值逐个调整上样剂量，再次对调整后的上样剂量进行凝胶电泳检测，使各样本间GAPDH的光密度值无差异，紧接着对每组以校正后的上样剂量分别进行凝胶电泳检测，将蛋白以200 mA、90 min的参数移到PVDF膜上，并使用一抗封闭液进行封闭12 h，其中一抗包括p-Iκbα、p-P65、cleaved Caspase(c-Caspase)-8、P65、c-Caspase-3、Iκbα、c-Caspase-9，封闭12 h后使用TBST清洗3次，接着放入对应的加有二抗的稀释液中进行避光孵育1 h，其中二抗为山羊抗兔IgG抗体，孵育结束后再用TBST清洗3次，并将其放入Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪中检测目的条带，同时应用Gel-Pro Application图像分析软件检测各组蛋白的光密度值，以代表其蛋白表达水平。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0进行数据分析。不同组间细胞凋亡率、凋亡相关蛋白相对表达量及TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达水平的比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1山奈酚对H9c2细胞活性的影响结果见图1。

2.2山奈酚对LPS诱导下H9c2细胞凋亡的影响结果见图2、表1。

图1 山奈酚对H9c2细胞活性的影响

A:对照组；B:LPS组；C：LPS+山奈酚组

表1 各组细胞凋亡率比较 %

F=412.690，P<0.001；*：与对照组比较，P<0.05；#：与LPS组比较，P<0.05

2.3山奈酚对LPS诱导H9c2细胞凋亡相关蛋白表达的影响结果见图3、表2。可知，LPS可提高c-Caspase-8、c-Caspase-9、c-Caspase-3蛋白表达水平，不同浓度山奈酚可抑制上述凋亡相关蛋白的表达。

1：对照组；2：LPS组；3：LPS+5 μmol/L山奈酚组；4：LPS+25 μmol/L山奈酚组；5：LPS+50 μmol/L山奈酚组

图3 各组细胞中凋亡相关蛋白的表达

*：与对照组比较，P<0.05；#：与LPS组比较，P<0.05

2.4山奈酚对LPS诱导H9c2细胞中TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达的影响结果见图4、表3。可知，不同浓度山奈酚可抑制LPS诱导的TLR4/NF-κB信号通路蛋白的表达。

1：对照组；2：LPS组；3：LPS+5 μmol/L山奈酚组；4：LPS+25 μmol/L山奈酚组；5：LPS+50 μmol/L山奈酚组

图4 各组细胞TLR4/NF-κB信号通路蛋白的表达

*：与对照组比较，P<0.05；#：与LPS组比较，P<0.05

3 讨论

该研究结果显示，和对照组相比，山奈酚可明显改善LPS引起的H9c2细胞活性降低，减少凋亡的发生，并且这种效应可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化从而发挥作用的，提示山奈酚可发挥抗心肌细胞炎症的作用，为临床治疗心肌炎提供了实验依据。有研究[5-6]证实，LPS可直接作用于心肌细胞产生TNF-α等炎性因子，这些炎性因子可刺激心肌细胞发生凋亡，同时可作用于成纤维细胞诱发心肌纤维化,从而加重心功能不全，在心肌损伤到心力衰竭的疾病进程中发挥促进作用。因此，如果能抑制LPS引起的心肌细胞炎症反应及凋亡，则可明显改善并预防心功能不全，从而改善患者的生存预后和生活质量。

山奈酚归属黄酮类化合物，主要存在于姜科植物山柰的根茎，也可见于各种水果、蔬菜中，生活中多食用富含山奈酚的食物可降低多种疾病的发病率，其具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化、抗菌的功效。既往研究显示，其具有抗动脉粥样硬化[7]、改善内皮功能作用，亦能改善体外培养的大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤[8]以及阿霉素诱导的心肌细胞损伤[9]。但山奈酚对LPS诱导的H9c2细胞凋亡的作用国内外尚无报道，因此作者选择了山奈酚作为一种新的抗心肌炎症药物进行进一步的研究。

既往研究[10-13]显示，心肌细胞凋亡在心血管疾病(心肌炎、缺血再灌注损伤、糖尿病心肌病、心力衰竭等)发展的不同阶段扮演不同的角色，在疾病早期可发挥一定的代偿作用，但随着疾病的进展，心肌细胞凋亡增多，可促进疾病的进展。心肌细胞在受到长期持续的炎症刺激后，细胞凋亡增多，诱发心室重构并发生类似扩张型心肌病样改变。因此，降低心肌细胞凋亡率可有效地抑制心室重构，改善心室重构的发生及发展。该研究结果显示，细胞经过不同干预因素处理12 h后，对照组凋亡率为(6.7±0.9)%；LPS组可显著增加H9c2细胞的凋亡率[(41.2±4.7)%]；LPS+山奈酚组的凋亡率则降低为(10.0±1.3)%。可见，山奈酚可显著降低LPS诱导的心肌细胞凋亡率，提示山奈酚具有抗心肌细胞凋亡作用，进而发挥心血管保护作用。

作者进一步研究了山奈酚发挥细胞保护作用的机制。NF-κB是一类经典的炎症信号分子，在心肌细胞炎症反应的病理过程中，NF-κB持续活化可介导炎症相关基因的转录，炎症因子又可作用于细胞膜本身的炎性因子受体，从而诱导内源性及外源性凋亡通路的活化发挥促凋亡作用[14-15]。在本研究中，作者发现山奈酚可显著抑制TLR4蛋白的表达，抑制Iκbα及P65的磷酸化，从而抑制NF-κB的核转位。因此，山奈酚可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路从而发挥抗H9c2细胞凋亡的作用。

综上所述，本研究发现山奈酚可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路从而发挥抗心肌细胞凋亡的作用，为山奈酚的临床应用提供了一定的证据。