EPCs移植对缺血再灌注肾损伤大鼠血管内皮生长因子的影响

周丽娜 王玉新 武 挺 方 林

1 厦门医学院附属第二医院肾内科，福建省厦门市 361021; 2 厦门大学附属中山医院泌尿外科

肾间质血管内皮损伤致管腔狭窄造成“无复流现象”，引起肾小管上皮细胞摄取的氧分和营养物质减少，导致其缺血、坏死，最终形成急性肾衰竭[1-2]。然而血管内皮细胞的损伤修复可预防或减轻肾小管上皮细胞的损伤[3-4]。1997年Asahara[5]提出内皮祖细胞(EPCs)可分化为成熟的内皮细胞,参与血管生成和内皮修复，除此以外，EPCs是否还可以通过其他作用机制修复血管损伤？据报道，VEGF能促进血管生成和血管内皮细胞生长,是促进血管生成的最高选择性、最强活性的因子[6-7]。EPCs移植能否通过上调VEGF的表达发挥对I/R肾损伤的保护作用，尚未见报道。本实验拟建立大鼠缺血再灌注肾损伤模型，通过观察EPCs移植对大鼠缺血再灌注损伤VEGF表达的影响，来探讨EPCs移植在修复缺血再灌注肾损伤大鼠内皮细胞的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组 22头SPF级雄性SD大鼠，重约220g，购自上海斯莱克实验动物有限公司[许可证编号：SCXK(沪)2007-0005]，随机分为对照组(n=6)、缺血再灌注损伤组(I/R，n=8)、 EPCs处理组(n=8)，分笼饲养于厦门大学动物实验科[实验动物使用许可证号：SYXC(闽)2008-0003]。

1.2 主要试剂 Histopague-1083(Sigma)、EBM-2细胞培养液(Lonza)、小鼠抗大鼠CD34抗体及小鼠抗大鼠VEGFR-2抗体(Santa cruz)羊抗鼠IgG-FITC(武汉博士德)、逆转录及PCR试剂盒(Promega)。

1.3 内皮祖细胞培养及鉴定 每100g大鼠用10%水合氯醛0.3～0.4ml麻醉。5ml外周血加入Histopague-1083,分离单个核细胞，重悬于细胞培养液，按密度5×106/ml接种于6孔板，置于细胞培养箱中。培养3d后，丢弃上清液，培养贴壁细胞。采用流式细胞仪检测外周血单个核细胞中CD34表达阳性的细胞、细胞免疫荧光鉴定内皮祖细胞表面标志CD34及VEGFR-2。

1.4 建立动物模型 大鼠缺血再灌注损伤(I/R)模型的制备采用切除右肾，夹闭左肾动静脉40min 后松开；假手术组仅切除右肾；在缺血再灌注损伤后从左肾动脉移植EPCs(5×106/2ml)至左肾作为EPCs组。分别在手术后1d收获大鼠。

1.5 生化指标检测 取大鼠外周血上机测定血肌酐及尿素氮等指标。

1.6 病理染色 取3组肾组织进行CD34免疫组化染色，用人工单盲法进行半定量评分[8]，阳性范围0分：无，1分：≤25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：﹥75%；阳性强度 1分：弱，2分：中，3分：强，4分：极强。二者相乘，即该例的阳性积分；每组总阳性积分/每组例数，为该组的阳性强度平均分。

1.7 RT-PCR检测大鼠肾脏VEGF mRNA的表达 提取肾皮质总RNA，反转录4μg。分别扩增VEGF和β-actin PCR。VEGF上游引物5’-AATGATGAAGCCCTGGAGTG-3’；下游引物5’- GAACAAGGCTCACAGTGATTTT-3’，产物179bp。内参β-actin上游引物5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3；下游引物5’-GGAAGGTGGACAGTGAGGC-3’，产物444 bp。反应条件为：95℃ 45s；53.6℃ 45s；72℃ 90s，共40个循环。用凝胶成像系统对PCR条进行扫描,并用4.62图像分析系统对吸收度A进行分析，以二者A比值为相对量。

2 结果

2.1 内皮祖细胞的鉴定 用密度梯度法分离获得单个核细胞进行贴壁培养，3d后形成“集落”(图1)。流式细胞计数显示外周血CD34细胞占(1.29±0.21)%(图2)。内皮祖细胞表面标志物CD34、VEGFR-2结果如图3。

图1大鼠外周血集落图2流式细胞仪检测大鼠外周血CD34+细胞百分比

注：放大倍数：A，×200；B，×400。 注：A：圈定单个核细胞为A门； B：同型对照；C：大鼠外周血CD34+阳性率1.29%。

图3 EPCs的鉴定免疫细胞荧光染色

注：A:CD34阳性(×100)；B:VEGFR-2阳性(×100)。

2.2 EPCs治疗前、后血肌酐、尿素氮水平比较 I/R组、EPCs组大鼠血肌酐、血尿素氮明显高于正常对照组(P<0.05)；移植EPCs后明显改善I/R组的肾功能(P<0.05)。详见表1。

表1 EPCs治疗前、后血肌酐、尿素氮水平及CD34阳性评分、VEGF mRNA表达水平比较

注：与正常组相比，#P<0.05;与I/R组比，*P<0.05 。

2.3 肾脏组织CD34蛋白表达水平 对各组大鼠肾组织进行CD34免疫组化检测。I/R组肾间质毛细血管内皮细胞密度明显低于正常对照组(P<0.05)，移植EPCs后明显增加了I/R组的肾间质毛细血管内皮细胞密度(P<0.05)。见表1、图4。

2.4 EPCs治疗前、后VEGF mRNA表达水平比较 与正常对照组比较，I/R组大鼠VEGF mRNA表达明显下降(P<0.05)，给予EPCs治疗后，治疗组大鼠VEGF mRNA表达较I/R组明显上升。见表1、图5。

图4 各组大鼠肾脏CD34免疫组化染色

注：A,阴性对照：免疫组化染色，DAB显色，苏木素套染(×100)。B,正常对照组：肾间质毛细血管内皮细胞见CD34表达。免疫组化染色，DAB显色，苏木素套染(×100)。C,I/R组：肾间质血管几乎未见CD34表达。免疫组化染色，DAB显色，苏木素套染(×100)。D,EPCs组：肾间质毛细血管内皮细胞见CD34表达。免疫组化染色，DAB显色，苏木素套染(×100)。

图5 大鼠肾组织VEGF mRNA RT-PCR产物电泳结果

注：由左至右电泳条带依次为1.Marker、2.normal组、3.I/R组、4.EPCs组。

3 讨论

急性肾衰竭是临床上常见的严重并发症之一，它可继发于多种疾病，如脓毒血症等。尽管目前的治疗水平较以往已有明显提高，但目前其死亡率仍高。众所周知，I/R肾损伤主要是始动于内皮的损伤，因此如何减轻血管内皮的损伤至关重要。内皮祖细胞作为多能造血干细胞之一具有促进血管修复的功能，其可在某些信号的刺激下被动员至损伤处，通过直接分化为成熟内皮细胞，或旁分泌机制，参与血管新生、重建和修复[9-13]。国内外有许多关于内皮祖细胞的报道。崔斌等人[14]利用球囊剥脱内皮构建大鼠颈动脉损伤模型，将内皮祖细胞从尾静脉移植至大鼠体内，研究发现EPCs可迁移至血管损伤处，通过促进血管的再内化过程及抑制平滑肌的增殖从而促进血管内皮的修复。Hecht 等人[15]将来源于胚胎的内皮祖细胞移植至慢性缺血性脑病的大鼠模型，实验结果显示内皮祖细胞和脑血管内皮细胞二者相互作用，同时内皮祖细胞还可通过间接旁分泌和自分泌信号机制，促进侧支循环生成，改善大脑血流。Bai 等学者[16]的研究也证实内皮祖细胞具有促进缺血性脑卒中大鼠血管再生的作用。除此以外，离体培养的内皮祖细胞可分泌VEGF，提示也可能通过旁分泌而起作用[17]。薛建新等[18]报道，VEGF165转染内皮祖细胞后可修复大鼠缺血再灌注肾损伤。Yi等[19]将VEGF 基因转染至内皮祖细胞发现其促进血流恢复效果较对照组明显。

自1980年首次提出血管内皮生长因子以来，其相关研究一直备受关注。血管内皮生长因子是糖蛋白化合物，是血管生成的主要细胞因子，对促进血管生成、提高血管通透性是非常重要的。此外,VEGF水平对血管内皮功能的评估和侧支循环的建立具有重要意义[20-21]。

在本次研究中，笔者观察到缺血再灌注损伤后，大鼠肾间质血管内皮细胞严重受损，同时肾功能明显下降，且其血管内皮生长因子的表达量也较正常对照组下降。笔者发现给予EPCs治疗后，大鼠肾间质的血管内皮细胞数量亦较I/R组增多、肾功能均较I/R组明显改善，且血管内皮生长因子的表达量较I/R组增加。因此推断，EPCs移植可修复损伤的血管内皮、改善缺血再灌注损伤大鼠的肾功能，该作用机制除了可能与其转分化为内皮细胞外，还可能也与其上调VEGF的表达促进血管修复有关。笔者的结论与薛建新等人报道具有一致性。本课题通过对EPCs移植治疗的研究，为今后ARF的治疗提供新的思路和实验依据，为开辟新的ARF防治途径提供相关科学依据。

随着内皮祖细胞的广泛研究，关于干细胞治疗为急性肾衰竭患者带来了希望，但由于内皮祖细胞促进血管修复机制尚未完全研究透彻，仍需要不断完善相关动物及临床实验、并且不断深入探讨其他可能的作用机制。同时由于实验经费和技术的影响，目前对于内皮祖细胞的表型鉴定等有待统一标准。如何使内皮祖细胞今后能被广泛应用于各个领域的治疗，目前还有诸多问题等待进一步研究探讨，若能成功攻克这些问题，干细胞治疗疾病的新时代即将到来。