一次离心法制备大、小鼠富血小板血浆实验条件的优化

孙振威，仓宝成，宁 群，赵敬湘，李鹏龙

(1.解放军第153中心医院临检中心,河南郑州 450042；2.解放军第153中心医院神经内科,河南郑州 450042；3.军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所,北京 100850)

研究表明，富血小板血浆(PRP)因含有多种生长因子，如血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(bFGF)等，在参与止血的同时，具有调控细胞增殖与分化，刺激血管和周围神经再生，促进伤口愈合等功能[1-3]。人们开展了大量的动物实验探索PRP在医疗领域的应用前景。然而，由于PRP的制备方法各不相同，产品质量参差不齐，研究者在相似的实验中往往得到不同甚至相反的实验结果[4-5]，严重影响了血小板相关研究的可靠性。

大、小鼠作为实验动物在PRP的研究中具有很多优点，如与人的基因同源性高，便于基因修饰，适于分子机制研究；有大量的鼠源抗体，便于进行免疫学研究；药品用量少，适于体内输注实验等[6-8]。大、小鼠血小板的提取方法也有很多种，既有白膜法，也有富血小板血浆法；既有二次离心法，也有一次离心法[9-15]。研究表明，小动物血小板提取过程中，由于血量较少，采用白膜法第一次离心后形成的血小板堆积层很薄，手工分离难度较大，故推荐采用富血小板血浆法[16]。同时，一次离心法的血小板提取率虽不及二次离心法，但其获得的血小板活性明显高于二次离心法，更适于血小板功能试验[17]。本研究旨在优化一次离心法制备大、小鼠PRP的实验条件，筛选出一种稳定可靠的血小板提取方法，为血小板相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠(270～340 g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物合格证号：SCXK(京)2012-0001]；SPF级雄性BALB/C小鼠(11～13周龄，24～28 g)购自军事科学院军事医学研究院动物中心[动物合格证号：SCXK-(军)]。常规饲养，实验当天从动物房取出。

1.2实验器材 小动物呼吸机(D79232 March，德国HSE)，无纺布滤器(X30，江苏东润)，高速离心机(Z-16PK，德国SIGMA)，动物血液分析仪(950FS，英国HEMAVET)，FS-PAK鞘液(英国Drew Scientific，批号：570265249)，戊巴比妥钠(北京化学试剂公司，化学纯)，肝素钠(国药集团，批号：20131016)，CPDA-1血液保养液(美国SIGMA-ALDRICH，货号：C4431)，0.9%氯化钠注射液(石家庄四药有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1麻醉 配制2.5%(g/mL)戊巴比妥钠溶液，分别腹腔注射0.23%、0.35%(容积/大、小鼠的体质量)的戊巴比妥钠溶液麻醉大、小鼠。

1.3.2取血 配制0.3%(g/mL)肝素钠溶液，湿润管壁后进行大鼠左侧股动脉插管放血，每只大鼠放血10 mL，加入14% CPDA-1抗凝，实验一次取血30 mL。对小鼠行气管插管通气，以吸入0.14 mL CPDA-1的注射器心脏穿刺取血1 mL，实验一次取血18 mL，贴壁缓慢注入50 mL离心管中，混匀[18]。

1.3.3滤白 超净工作台中，取出无菌滤器(滤过直径5～10 μm)，上端连接拔除针头和内芯的10 mL注射器，下端紧贴另一离心管管壁，将全血缓慢注入上端注射器管内，依靠重力作用使血液自然滤过。

1.3.4离心 将滤除白细胞的血样每份1.5 mL分装入无菌的5 mL EP管中，封口膜封口，22 ℃条件下离心。血样分成两层，上层为PRP层，下层为红细胞层。超净工作台中用移液器转移上层PRP于另一无菌EP管中。离心过程中以离心力和离心时间为考察因素，进行正交设计。大鼠血样离心过程中离心力分别取300×g、400×g、500×g、600×g 4个水平，小鼠血样离心过程中离心力分别取300×g、400×g 2个水平，离心时间均取4、6、8、10、12 min 5个水平，每个试验点重复3次，见图1。

注：A为14%CPDA-1抗凝全血；B为白细胞滤除过程；C为滤白全血离心后血液分层

图1 PRP提取过程

1.3.5计数 测定抗凝全血、滤除白细胞后的血样和离心后的上层PRP体积，各自混匀后取100 μL用动物血液分析仪进行细胞计数，计算白细胞滤除率和不同离心方法的血小板回收率。白细胞滤除率=1-(滤除白细胞后血样体积×血样中白细胞计数)/(抗凝全血体积×全血中白细胞计数)；血小板回收率=(富血小板血浆体积×富血小板血浆中血小板计数)/(滤除白细胞后血样体积×血样中血小板计数)。

2 结 果

2.1白细胞滤除率 大、小鼠抗凝全血白细胞滤除率分别为(88.32±4.18)%和(85.16±6.06)%，滤除白细胞前后血样中红细胞、血小板计数结果差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2大鼠血小板回收率 在4～12 min的时间段内，随着离心时间的延长，300×g离心力条件下，血小板回收率逐渐升高；400×g离心力条件下，血小板回收率先升高再降低，并在离心8 min时达到峰值；500×g和600×g离心力条件下，血小板回收率逐渐降低。见表1。

表1 不同离心条件下大鼠血小板回收率(%)

2.3小鼠血小板回收率 在4～12 min时间段内，随着离心时间的延长，300×g离心力条件下，血小板回收率先升高再降低，并在离心8 min时达到峰值；400×g离心力条件下，血小板回收率逐渐降低。见表2。

表2 不同离心条件下小鼠血小板回收率(%)

3 讨 论

全血中各组分的密度不同是离心法提取血小板的基础。在离心过程中，红细胞由于密度最大最先沉降于底部，血浆由于密度最小而形成上清层，白细胞和血小板的密度介于红细胞和血浆之间，随着离心过程的深入逐渐堆积于两者之间形成白膜层。本研究选用的无纺布滤器可有效滤除直径10 μm以上的白细胞，且对直径5 μm以下的血小板有良好的透过性[19]，提高了一次离心法制备PRP的纯度。一次离心法制备PRP实验条件优化的意义在于寻找到形成白膜层前的临界状态，以尽可能简单并最大量获取上层血浆中的血小板。

离心法提取血小板过程中影响血小板回收率的因素有很多，如采血过程、抗凝方法、样本量、离心力、离心加速度、离心时间、离心温度、离心机类型等，其中以离心力和离心时间影响最为显著[16]，本研究在固定其余参数的基础上，重点对这两项实验条件进行了优化。KÜÇÜK等[10]、MAMMOTO等[11]和HOSHI等[13]采用一次离心法提取大、小鼠血小板时多把离心力设定在100×g～700×g，离心时间设定在5～15 min。根据预实验结果，以300×g～600×g的离心力和4～12 min的离心时间为考察因素，进行正交试验设计，综合考察了二者对血小板回收率的交互影响作用。

研究表明，离心力相同的情况下，随着离心时间的延长，PRP的体积逐渐增大，PRP中血小板的计数值逐渐减少。随着离心力的增加，PRP体积增大的速度和PRP中血小板计数减少速度加快。探寻最佳离心条件的过程即是在PRP体积与PRP血小板计数值此消彼长的过程中获取二者最大乘积时的离心力和离心时间。本实验发现，大、小鼠抗凝全血滤除白细胞后分别以400×g和300×g的离心力离心8 min时，血小板回收率最高。离心力和离心时间应该保持在一定范围内，不宜过大或过小。如果离心力过小或离心时间过短，则离心后分离出来的PRP体积有限，血小板回收率较低。相反，如果离心力过大或者离心时间过长，则血液中的血小板大部分进入白膜层，PRP中血小板计数值很低，血小板回收率同样不高。

4 结 论

选择合适的离心力和离心时间，达到白膜形成前的临界状态，是一次离心法制备PRP的关键。本次实验条件范围内，大、小鼠抗凝全血滤除白细胞后分别以400×g和300×g的离心力离心8 min时，血小板回收率最高。