埃博拉病毒疫苗的研究进展

王寅彪 王利平 李鹏

1 前言

2014年暴发的埃博拉病毒病（EVD）给西非多国造成了重大人员伤亡和经济损失，并在英国和美国等国家本土出现感染病例，被WHO 称为“联合国成立以来最严重的公共卫生危机”。EVD 又称埃博拉出血热，是由埃博拉病毒（EBOV）感染人或非人灵长类动 物（NHP）引起的一种烈性传染病，病死率高达90%，感染者以出血、发热、低血压、多脏器受损等为主要临床表现。EBOV 与马尔堡病毒（MARV）同属于丝状病毒科，为有囊膜的单股负链RNA 病毒，其基因组大小约19 kb，编码7 种蛋白：核蛋白（NP）、VP35、VP30、L、糖蛋白（GP）、VP40 和VP24 蛋白。根据发生地和抗原特性不同，EBOV可分为：扎伊尔型（ZEBOV）、苏丹型（SUDV）、本迪布焦型（BDBV）、塔伊森林型（TAFV）和雷斯顿型（RESTV）；除了RESTV对人不致病外，其余4 种EBOV 感染均可导致人发病，其中ZEBOV 和SUDV 对人有致死性。EBOV 的GP蛋白在病毒囊膜表面形成三聚体，介导病毒入侵宿主靶细胞，是诱导中和抗体产生的重要蛋白，几乎所有EBOV 候选疫苗均使用GP 蛋白作为免疫原。

2 EBOV 疫苗

现有的EBOV 疫苗有DNA 疫苗、重组亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗及病毒载体疫苗等。常用的评价EBOV 疫苗效力的小型实验动物模型有小鼠、豚鼠和叙利亚金黄地鼠，非人灵长类动物（NHP）模型有恒河猴、猕猴和狨猴。当前对于EBOV 感染的免疫清除机制尚不清楚，也无明确的保护性指标。疫苗免疫后，通常利用结合实验检测抗体与重组蛋白或与灭活病毒粒子的结合能力对体液免疫水平进行评价，利用病毒中和试验测定抗体的中和活性；细胞免疫水平一般通过细胞内细胞因子染色法（ICS）或酶联免疫斑点检测（ELISPOT）测定病毒抗原特异性细胞因子或分泌特异性细胞因子的细胞频率进行 评价。

2.1 DNA 疫苗

DNA 疫苗采用在体内表达外源基因的方式可模仿病毒感染，诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的产生。使用表达GP 或NP 蛋白的DNA疫苗进行3～4 次免疫（1.5 μg/次）可保护小鼠免受致死剂量EBOV 攻毒。表达GP 蛋白的多价丝状病毒疫苗可保护小鼠和豚鼠免受致死剂量EBOV 和MARV 的攻毒，该疫苗可诱导产生显著的杀伤性T 淋巴细胞（CTL）应答。在NHP 免疫实验中，肌肉电转（500 μg/次）表达GP 蛋白的质粒3 次可诱导猕猴体内产生高水平的中和抗体并保护其抵抗致死剂量EBOV 攻毒（5/6）。使用表达GP 或NP 蛋白的DNA 疫苗进行的I期临床试验表明DNA 疫苗安全性高，免疫原性良好，能诱导机体产生GP 或NP 蛋白特异性抗体及特异性CD4+T 和CD8+T 细胞免疫。虽然DNA 疫苗可量产，而且产生的副反应较轻，但需要进行多次免疫才能起到相应的保护效果。

2.2 重组亚单位疫苗

重组亚单位疫苗具有纯度高、安全性好等特点，可使用原核（如大肠杆菌）和真核（如杆状病毒）等表达系统进行大量制备，其免疫效果受免疫次数、佐剂类型等影响较大。PHOOLCHAROEN 等利用在本生烟草中表达的EBOV_GP1 蛋白及其单抗复合物与不同的佐剂混合对小鼠进行4 次免疫获得了80%以上的保护率，且发现IgG2a 与保护率非常相关，与之前研究发现给小鼠被动免疫IgG2a 单抗可对EBOV 攻毒起到保护作用的结果一致。KONDURU 等使用CHO细胞表达了EBOV GP 蛋白胞外区与人源IgG1Fc段的融合蛋白作为疫苗免疫小鼠4次，诱导产生了GP 蛋白特异性的T细胞应答及中和抗体，并能够保护小鼠免于致死剂量EBOV 攻击（7/8）；而且，此融合蛋白可形成同源三聚体，与天然病毒粒子上的GP 蛋白结构类似，具有用作安全、高效的亚单位疫苗的潜力。KONDURU 等同样利用豚鼠实验测试了GP-Fc 疫苗的免疫效力，发现以Poly-ICLC 作为佐剂时，能够100%保护豚鼠免于致死剂量EBOV 攻毒，而且发现以此种亚单位疫苗免疫豚鼠后产生的GP蛋白特异性抗体水平与保护率之间并无相关性。相对于GP 蛋白而言，VP24 和VP40 蛋白在丝状病毒中的保守性非常高，适用于通用疫苗制备，而且VP24 和VP40 蛋白能够诱导细胞免疫应答，从而增强宿主的保护性免疫应答。LEHRER 等使用果蝇 S2 细胞共表达了 EBOV 的GP、VP24 和VP40 蛋白，该疫苗在小鼠体内免疫原性非常强，能够100%保护小鼠免于致死剂量EBOV攻毒，即便在未使用佐剂的情况下进行3 次免疫后也能获得70%的保护率。

2.3 病毒样颗粒疫苗

病毒样颗粒疫苗（VLP）是不含病毒核酸，形态类似于天然病毒粒子的一类疫苗，具有安全性好，免疫原性高等优点，能够被APC 细胞高效识别，刺激免疫应答产生，已在HIV 病毒、HBV 病毒、HPV 病毒、流感病毒、MARV 病毒疫苗研制中进行过测试。WARFIELD 等向HEK 293T 细胞中共转染表达EBOV GP 蛋白、VP40 蛋白和NP 蛋白的质粒制备了VLP 疫苗，免疫后对小鼠、豚鼠、猕猴均提供了100%保护率；而且，共表达EBOV 的GP 蛋白与MARV 的VP40 蛋白或共表达EBOV的VP40 蛋白与MARV 的GP 蛋白时，均能形成VLP，为制备抗丝状病毒的通用疫苗提供了依据。VLP疫苗免疫同样受佐剂类型影响，使用模式识别受体PRR 的激动剂作为佐剂时，可有效提高疫苗效力。BENGTSSON 等利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达了EBOV 的GP 蛋白，纯化后GP 蛋白形成了30～40 nm 的颗粒，与Matrix-M 佐剂混合免疫小鼠3 次后对致死剂量EBOV 攻毒提供了100%保护率，而使用Al-PO4 作为佐剂时则无保护性，单独使用GP 蛋白免疫后保护率为10%，而且Matrix-M 佐剂组的小鼠能够迅速产生GP 蛋白特异性IgG及中和抗体，骨髓中GP 蛋白特异性B 细胞持续周期更长，分泌GP 蛋白特异性IFN-γ 的T 细胞数量更多。

2.4 病毒载体疫苗

用于EBOV 疫苗制备的病毒载体有：腺病毒（rAdv）、痘病毒（MVA）、水疱性口炎病毒（VSV）、复制型人副流感病毒（HPIV）、狂犬病毒（rRABV）、巨细胞病毒（CMV）、基于委内瑞拉马脑炎病毒（VEE）的RNA 复制子（VRP）等。在美国、欧洲及非洲进行临床测试的EBOV 疫苗均以GP 蛋白为靶标，其中一些采用单针免疫，一些采用2 次免疫（首免＋加强免疫不同的疫苗，heterologous prime-boost approach），2 次免疫比单针免疫免疫效果更好，但2 次免疫的推广受限于EBOV 流行地区的经济条件及后勤运输保障等因素。而且，EBOV病毒载体疫苗因使用的载体和测试动物不同，产生的免疫应答的情况各异。VSV 载体疫苗免疫NHP 后产生的体液免疫应答对保护至关重要，细胞免疫应答在单针rAdv 载体疫苗免疫后产生的免疫保护中至关重要。体液免疫及细胞免疫均对NHP抵抗EBOV 感染具有保护作用，人体自然感染EBOV 后也能够同时产生体液免疫和细胞免疫，因此，良好的EBOV 疫苗应能够同时诱导产生较长持续周期的细胞免疫力和抗体水平。

2.4.1 基于腺病毒载体的EBOV 疫苗LEDGERWOOD 等制备了表达GP 蛋白的人腺病毒5 型载体疫苗（rAd5-GP），并进行了单针免疫临床测试，该疫苗安全性较好，但免疫效果受机体内腺病毒预存抗体的制约而使得GP 蛋白特异性抗体滴度较低。增加免疫剂量虽然能够克服这一缺陷，但与此同时也增强了副反应，而且预存的5 型腺病毒抗体能够增加受试者感染HIV 的风险。基于复制缺陷型黑猩猩3 型腺病毒载体制备的 EBOV 疫苗（ChAd3-GP）于2014—2016年分别在美国、英国、瑞士及非洲马里开展了 I期临床测试：单针免疫该 疫苗在受试者体内产生了显著的体液免疫应答及细胞免疫应答，且抗体水平持续6个月依旧明显，该疫苗产生的副作用较轻，安全性较好，同时减少了预存抗体的干扰。我国研究人员制备了表达2014 基因型EBOV 流行株GP 蛋白的rAd5 疫苗，已在我国及塞拉利昂健康成人中进行了I期和II期临床试验，单次免疫8.0×1010个病毒粒子可诱导GP蛋白特异性抗体及细胞免疫应答的产生，且为冻干型，常温下可稳定 热带地区使用。

2.4.2 基于MVA病毒载体的EBOV疫苗改良型痘苗病毒安卡拉株载体（MVA）是一种复制缺陷型病毒载体，已被用于天花、疟疾、流感及结核疫苗研发。表达EBOV 病毒GP 蛋白的MVA（MVAGP）疫苗 免疫豚鼠后仅提供了部分保护，3 次免疫猕猴之后，动物均出现了病毒血症。因此，当前MVA-GP 疫苗主要被用作加强免疫。ChAd3-GP 免 疫NHP 后可在短期内对EBOV 攻毒感染提供100%免疫保护，然而要想10个月后仍获得完全保护，则需要使用MVA-GP 疫苗作加强免疫。鉴于这种首免+加强免疫的策略在临床前试验中提供的超强保护持续期，一些I期临床试验在人群中测试了这一方案。与ChAd3-GP 疫苗单针免疫相比，使用ChAd3-GP 首免，2～3个月后加强免疫表达EBOV、SUDV 及MARV 病毒GP 蛋白及TAFV 病毒NP 蛋白的重组MVA 载体疫苗在人体内获得了更好的安全谱，显著增强了细胞免疫应答及体液免疫应答。

2.4.3 基于VSV 病毒载体的EBOV疫苗重组水疱性口炎病毒（VSV）能够有效递送外来抗原，已在HIV病毒、流感病毒、丙肝病毒和乙肝病毒等疫苗研制中得到应用，而 且机体内预先存在VSV 病毒抗体的可能性较小。对NHP 单针肌肉注射1×107pfu 的rVSV-GP（ZEBOV）疫苗28 d 后，能够保护其免受致死剂量的同源ZEBOV 病毒（1000 pfu）的攻击，但对SUDV 攻毒无交叉保护，对rVSV-GP 诱导保护的机制进行研究后发现抗体应答在保护中不可或缺，而且抗体水平与保护率直接相关。另外，肌内免疫rVSV-GP（ZEBOV）疫苗后可保护以气溶胶方式进行的ZEBOV 攻毒，而且通过鼻腔或口腔黏膜免疫该疫苗也可保护以肌肉注射进行的ZEBOV攻毒，表明黏膜免疫同样在rVSV- GP（ZEBOV）疫苗免疫后产生的保护中发挥重要作用。最近一项研究表明使用rVSV-GP 疫苗免疫NHP 7 d 即可为致死剂量ZEBOV 攻毒 提供100% 保护，因此，该疫苗可用于保护一线医疗救护人员及受感染威胁的社区，从而在早期减少疫情的扩散。GEISBERT 等则利用rVSV表达了多种丝状病毒的GP 蛋白，混合制备了通用疫苗，免疫NHP 后可保护动物同时免受EBOV（ZEBOV，SUDV，TAFV）及MARV 感染。

2.4.4 基于副黏病毒载体的 EBOV疫苗人3 型副流感病毒（HPIV-3）是一种引起儿童下呼吸道感染的副黏病毒（paramyxovirus）。单次鼻腔内免疫表达EBOV 病毒GP 或NP蛋白的重组人3 型副流感病毒疫苗（rHPIV3/ZEBOV-GP 或rHPIV3/ ZEBOV-GP/NP）可以保护豚鼠免受致死剂量EBOV 病毒攻击，通过呼吸道途径2 次免疫恒河猴也可提供100%保护。MEYER 等对比了通过呼吸道途径免疫气溶胶形式的rHPIV3/ZEBOV-GP 疫苗、液体形式的rHPIV3/ZEBOV-GP 疫苗及肌肉免疫表达GP 蛋白的委内瑞拉马脑炎病毒（VRP-GP）产生的免疫应答，发现气溶胶形式的rHPIV3/ZEBOV- GP 疫苗诱导产生了更高水平的血液和黏膜IgG、IgA 及中和抗体，更强程度的CD4＋T 细胞应答，而且单次气溶胶疫苗免疫为猕猴提供了100%保护率。虽然呼吸道免疫rHPIV3 载体疫苗可使受试者免于针注，但其免疫效果可能受到体内预存抗体的影响。

2.4.5 基于其他病毒载体的EBOV疫苗BLANEY 等制备了表达EBOV 病毒GP 蛋白的重组狂犬病毒疫苗（rRABV/ZEBOV-GP），这种2 价疫苗免疫可同时预防狂犬病毒及EBOV 的感染，单次免疫即可对致死剂量EBOV 攻毒提供100%保护，而且保护作用与抗体应答相关，其中IgG1 型抗体应答在免疫保护中起重要作用。

巨细胞病毒（CMV）可在其宿主群体中重复感染与传播，不受预存免疫力的影响。TSUDA 等制备了表达ZEBOV 病毒NP 蛋白CTL 表位（43-54 aa）的重组CMV 疫苗，单次免疫该疫苗后，较快诱导产生了此表位特异性的CTL 应答，2 次免疫小鼠后，可使其经受住致死剂量EBOV 攻毒，但体内仍存在EBOV病毒复制，这一结果表明CTL 应答在免疫保护中起重要作用，但需要在其他动物模型上进行更多验证。

PUSHKO 等基于委内瑞拉马脑炎病毒（VEE）制备了RNA 复制子疫苗（VRP-GP 及VRPNP），单独免疫VRP-GP 或与VRP-NP 同时免疫能够对小鼠和豚鼠起到保护作用，仅免疫VRP-NP 只保护小鼠，不保护豚鼠，研究未发现抗体水平与保护率之间的相关性。HERBERT 等 发现单次经肌肉注射VRP-SUDV-GP与VRP-ZEBOV-GP能够完全保护猕猴免受致死剂量ZEBOV 或SUDV攻击。

3 研究展望

当前已进入临床测试的EBOV疫苗有DNA 疫苗、rAd5 疫苗、ChAd3疫苗及rVSV 疫苗。DNA 疫苗免疫原性稍弱，需要进行多次免疫；rAd5疫苗可受预存抗体的干扰，需要使用较高的剂量予以克服；ChAd3 疫苗免疫可在短期内提供较好保护，但持续期有待延长，故多采用ChAd3疫苗进行首免，MVA 疫苗作加强免疫；rVSV 疫苗能够在10 d 内诱导产生免疫保护，仍需更多临床测试来确定免疫保护的持续期。针对EBOV感染的免疫保护机制是复杂的，而且这一机制针对不同类型的疫苗也不一样，大多数疫苗测试中，GP 糖蛋白特异性的体液免疫力不可或缺且足以保护受试者免受感染；细胞免疫对单针rAdv 载体疫苗免疫后产生的保护至关重要，而且CD8+T 细胞应答在VLP（GP-VP40）免疫后产生的保护中也是必需的。鉴于传染病的暴发具有不可测性，对一线医疗救护人员单针普免丝状病毒多价疫苗是应对此种突发公共卫生事件所必需的。多价丝状病毒疫苗研究是未来EBOV 疫苗发展的方向。同时，为更好防止病毒进入人群，制备供野生动物使用的EBOV 疫苗对于保护人群健康也具有重要作用，这有待于对EBOV 储存宿主的进一步确证，从而在传播的早期阶段或者针对中间宿主或终末宿主如猿类进行干预。◆