埃博拉病毒病：病原学、致病机制、治疗与疫苗研究进展

程颖 刘军 李昱 刘翟 任翔 施一 高福 余宏杰

埃博拉病毒病（Ebola Virus Disease）以往称埃博拉出血热（Ebola Hemorrhagic Fever）。目前国内统称为埃博拉出血热，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和美国疾病预防控制中心（Centersfor Disease Control and Prevention，US CDC）已将埃博拉出血热更名为埃博拉病毒病。该病是埃博拉病毒（Ebolavirus）感染所致的一种急性传染病，病死率可高达90%，是病死率最高的传染病之一。2013年12月，地处西非的几内亚开始出现埃博拉病毒病暴发疫情，随后在利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚等西非国家相继暴发。截至2014年8月15日，上述西非4国已报告2127例埃博拉病毒病病例，死亡1145人。2014年8月8日，世界卫生组织宣布西非埃博拉病毒病疫情为“国际公共卫生紧急事件”，进一步引起了国内外媒体和公众的广泛关注。我国与西非国家在劳务、商务、留学教育等领域合作紧密，相关人员往来密切，还有援外医疗队常驻西非国家，虽然尚无确认埃博拉疫情，但随时面临输入风险。为加深对该病的科学认识和应对准备，现对其病原学特征、致病机制、治疗和疫苗研究进展进行综述。

1 病原学特征

1.1 形态

埃博拉病毒属与马尔堡病毒属和Cuevavirus 属同归为丝状病毒科。埃博拉病毒为单股负链、不分节段、有囊膜的RNA 病毒，于1976年被首次分离。在电子显微镜下，该病毒一般呈现线形结构，也可能出现“U”字、“6”字形、缠绕、环状或分枝状等多种形态。病毒直径80 nm 左右，但长度变化很大，一般为1000 nm，最长可达14000 nm，病毒基因组大小约19 kb。

1.2 基因组

成熟的病毒体由位于中心的核衣壳（Nucleocapsid）和外面的囊膜（Envelope）构成。核衣壳与囊膜之间的区域，称为基质空间，由病毒蛋白VP40 和VP24 组成。位于病毒体中心的核衣壳蛋白由螺旋状缠绕的负链核糖核酸与核蛋白（NP）、病毒蛋白VP35 和VP30、RNA 依赖的RNA 聚合酶（L）组成。病毒囊膜来自宿主的细胞膜，糖蛋白（GP）为跨膜蛋白，形成三聚体刺突，包含由二硫键链接的糖蛋白1 和糖蛋白2 两个碱性蛋白酶裂解片段。

埃博拉病毒基因组编码7个结构蛋白和2个非结构蛋白。基因顺序为3′端-NP-VP35-VP40-GP-VP30- VP24-L-5′端，两端的非编码区含有重要的信号以调节病毒转录、复制和新病毒颗粒包装。除编码糖蛋白的基因外，所有基因均为一个单顺反子，编码一个结构蛋白。基因组所编译的蛋白中，NP 是核衣壳蛋白，VP30 和VP35 是病毒结构蛋白，VP35 具有拮抗 Ⅰ 型干扰素作用，GP是跨膜糖蛋白，与病毒的入侵过程及细胞毒性有关，VP24 和VP40 与病毒的成熟释放有关，前者是小型膜蛋白，后者构成病毒基质蛋白。RNA 依赖的RNA 聚合酶（L），是病毒基因组转录成信使RNA 所必需的酶，它对病毒基因组的复制也有重要作用。另外，可溶性的糖蛋白（sGP）和小可溶性糖蛋白（ssGP）与跨膜GP 约有300个氨基酸相同，大小分别为60～70 kD 和全长度的150～170 kD，经过相同基因转录编辑过程，sGP 和ssGP 与埃博拉病毒细胞毒性有关。

1.3 分型与变异

埃博拉病毒病一直被认为是动物源性传染病，但其在自然界确切的传播和循环方式尚不清楚。现有证据支持的假说认为，埃博拉病毒通过其自然储存宿主果蝠传给大猩猩、黑猩猩等非人类灵长类动物，果蝠和这些灵长类动物均可将埃博拉病毒传给人，然后病毒在人与人之间传播，最终引起人群中暴发流行。目前，确认埃博拉病毒属包括5个种：扎伊尔型（Zaïre ebolavirus，EBOV）、苏丹型（Sudanebolavirus，EBOV）、塔伊森林型（Taï Forest ebolavirus，TAFV，又叫科特迪瓦型或象牙海岸型）、本迪布焦型（Bundibugyoe ebolavirus，BDBV，又叫乌干达型）和莱斯顿型（Reston ebolavirus，RESTV）。前4 种埃博拉病毒都有感染人类并导致类似临床症状的报道，目前仅在非洲发现。它们的毒力不同，所致疾病的病程进展也各不相同，病死率约为25%～90%。其中，扎伊尔型对人致病性最强，苏丹型、本迪布焦型、塔伊森林型，对黑猩猩致病性强，对人较弱。莱斯顿型曾在菲律宾的猕猴暴发疫情中发现，也曾在美国和意大利从菲律宾进口的猕猴中发现，2008年首次在菲律宾的猪中分离到该型病毒。莱斯顿型可以感染人类，但至今尚无引起疾病或死亡的报道。2011年我国曾在猪中检出莱斯顿型病毒RNA，但缺乏病毒分离的结果。

埃博拉病毒的进化速率约为7×10–4突变位点–1年–1。1976年发现扎伊尔型埃博拉病毒以来，埃博拉病毒40年里积累了大量的突变。目前已发现的EBOV 病毒株都是1976年的毒株突变而来。但是全基因组测序分析显示，此次西非疫情的几内亚毒株与已发现的刚果EBOV 病毒株的同源性只有97%，并形成独立进化支，该毒株与刚果和加蓬EBOV 型平行进化，源自共同祖先，并非由其他两国传入几内亚。然而，仍有德国科学家认为此次暴发疫情的病毒株可能来源于中非。

1.4 抵抗力

埃博拉病毒对热有中度抵抗力，在室温及4℃存放1个月后，感染性无明显变化，但在60℃条件下60 min 可被杀死。还可以通过紫外线、γ 射线、煮沸灭活5 min 等方式灭活病毒。同时，该病毒还对次氯酸钠和消毒剂敏感，但冰冻或冷藏无法灭活病毒。

2 致病机制

埃博拉病毒属生物安全级别最高的A 类病原，对活病毒的操作需要在生物安全4 级实验室进行，包括实验动物接种、细胞培养、病毒分离等。埃博拉病毒的主要靶细胞是血管内皮细胞、肝细胞、巨噬细胞等，通过抑制天然和获得性免疫应答反应，增加血管通透性，引起肝脏为代表的多脏器损伤，引发严重的发热、出血、休克、多器官功能衰竭等症状，重者可致死亡。

2.1 病毒感染靶细胞和组织

埃博拉病毒感染机体后，通过刺突糖蛋白与宿主细胞膜表面的受体结合进入细胞。原位杂交和电子显微镜显示，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、肝细胞、肾上腺细胞，以及多种上皮细胞对病毒复制起重要作用。其中单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞是早期被感染的细胞和主要的病毒复制场所，进而使病毒由感染部位进入淋巴结、肝脏和脾脏等器官。病毒对靶细胞的感染具体包括，（ⅰ）受到感染的单核细胞和巨噬细胞释放多种细胞因子和趋化因子，包括肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1β（IL-1β）、活性氧和一氧化氮等，引起单核细胞和巨噬细胞的聚集，并激活中性粒细胞，进一步扩大炎症反应。同时，受到感染的单核细胞和巨噬细胞表达多种与凝血功能异常密切相关的细胞因子。因此，单核细胞和巨噬细胞不仅无法清除埃博拉病毒，反而协助病毒增殖，并将病毒转运、扩散至宿主全身。（ⅱ）埃博拉病毒可在重要的抗原呈递细胞（APC），如树突状细胞（DC）内完成增殖。（ⅲ）通过糖蛋白或病毒感染，可直接破坏细胞结构，损伤肝、肾上腺皮质、脾脏等组织器官。人类和非人灵长类动物感染后，肝脏出现不同程度灶状坏死，引发凝血功能障碍；肾上腺皮质细胞坏死，导致血管血压调节障碍。

2.2 免疫应答反应受到抑制

包括天然免疫及获得性免疫应答均受到抑制，（ⅰ）天然免疫应答，如干扰素产生受到抑制。病毒蛋白VP24 中止了蛋白信号转导和活化因子1（STAT1）在细胞核内积聚过程，通过阻止I 型干扰素的信号抑制干扰素产生；病毒蛋白VP35 通过阻断干扰素调节因子3（IRF-3）的活性，降低干扰素的作用，使周围的正常细胞失去保护。（ⅱ）获得性免疫应答的多个环节受到抑制：（1）树突状细胞作为重要的抗原呈递细胞，处于机体天然免疫和获得性免疫防御病原体的核心环节。体外实验表明，埃博拉病毒感染后的髓系树突状细胞将无法释放集落刺激因子等细胞因子，不能发育成熟，从而无法上调主要组织相容性复合物（MHC）分子的表达，激活淋巴细胞。树突状细胞功能的异常，意味着无法正常激活重要的体液和细胞免疫应答过程；（2）通过TRAIL 和Fas-FasL 途径，引起大量淋巴细胞凋亡，导致CD4＋和CD8＋T 细胞的锐减。猕猴感染病例的研究显示，病毒主要导致体内T 细胞和NK 细胞凋亡。淋巴细胞凋亡，部分解释了死亡病例进展性的淋巴细胞减少和淋巴耗竭。2000年乌干达埃博拉疫情暴发时，重症病例出现循环T淋巴细胞减少，但幸存者淋巴细胞数量未见明显减少。另外，可溶性介质（如NO 等）的非正常产生，病毒糖蛋白C 末端免疫抑制性基序的识别或直接介导淋巴细胞功能破坏或细胞减少。（ⅲ）胸腺、淋巴结和脾脏等重要免疫器官，出现耗竭和坏死，而炎症细胞少见。

对比感染埃博拉病毒后康复者和病情恶化者的临床表现和免疫反应发现，抗原特异性细胞介导的免疫反应的发展和病毒的清除成正相关。然而，给感染埃博拉病毒的猕猴被动输注埃博拉病毒人源中和性单克隆抗体KZ52，却无法控制感染。因此，免疫球蛋白的保护作用尚不明确。但可以肯定的是，感染早期正常的、短暂的天然免疫应答，以及随之激活的获得性免疫应答，对于保护机体免受致命性感染是必需的。最近3 种单克隆抗体联合使用的鸡尾酒疗法被证明有效。

2.3 血管损伤

关于血管内皮细胞损伤的分子机制尚待研究。现有研究显示，糖蛋白是血管细胞损伤的重要因子，再加上病毒对内皮细胞结构的直接破坏，最终导致出血症状。但尸检并未见明显血管损伤。并且有研究显示，内皮细胞感染偶然发现于食蟹猴病毒感染的晚期。血小板减少症、凝血因子消耗和纤维蛋白降解产物滴度增加，是埃博拉病毒感染后凝血病理表现。埃博拉病毒病中凝血异常与弥散性血管内凝血一致。因此，凝血因子合成下降以及肝功受损导致血浆蛋白异常与出血倾向有关。肾上腺皮质受损后，会导致低血压和低血容量低钠血症。该症状几乎见于所有感染者，并在出血晚期的休克过程中起重要作用。病毒感染后还引发众多炎症因子IL-2，6，8，10，天然抗凝蛋白C 等释放，导致了疾病晚期出血和休克的发生。值得关注的是，NO 在非人灵长类动物感染扎伊尔型病毒，以及人类感染扎伊尔型和苏丹型病毒后，滴度升高，并显示与死亡相关。NO 不正常产生，与旁路淋巴细胞凋亡、组织损伤和血管缺乏完整性等众多病理生理紊乱有关。另外，NO 也是重要的低血压介质。

目前认为，APC 细胞的感染和激活是埃博拉病毒病发展的重要基础。APC 细胞以及其他细胞释放的炎症促进因子、趋化因子和其他介质，造成血管和凝血系统的损伤，引发多器官功能衰竭以及类似中毒性休克的症候群。

3 治疗研究进展

3.1 抗病毒药物

抗流感病毒药物-法匹拉韦（favipiravir）（T-705，商品名Avigan）是针对埃博拉病毒病研究进展较快的抗病毒药物。T-705 作为嘌呤类似物，可引发RNA 病毒复制过程紊乱，从而阻碍病毒增殖。实验证实，T-705 还能抑制黄病毒科的西尼罗病毒、黄热病毒和口蹄疫病毒等，因此，对于同属RNA 病毒的埃博拉病毒可能有效。该药已在日本批准上市用于治疗流感，目前在美国通过了 Ⅱ期临床试验。广谱抗病毒药物BCX4430，属于小分子的腺苷类似物，被整合进病毒RNA 复制过程后，使得病毒RNA 空间构型改变，从而严重影响后续转录、翻译过程。BCX4430 对马尔堡病毒和扎伊尔型埃博拉病毒效果明显，目前该药已经进入临床试验阶段。广谱抗病毒药物三氮唑核苷（ribavirin，利巴韦林），通过干扰病毒mRNA的帽化阻碍病毒复制，用于治疗布尼亚等病毒引起的出血热。由于缺乏针对丝状病毒的体内、体外实验数据，加上严重的副作用，不推荐利巴韦林用于治疗埃博拉病毒病。

3.2 生物治疗

目前针对埃博拉病毒病的治疗主要是基于混合多种抗体的鸡尾酒疗法等生物治疗和支持治疗。其中ZMapp 是由美国与加拿大联合研制的药物，包含3 种人源化的单克隆抗体，通过植物细胞表达系统（烟草 属）表达生产。属于优化的鸡尾酒疗法，包含针对埃博拉病毒感染有保护效果的单克隆抗体组合MB003和ZMAB 中最有效的成分。ZMapp 在非人类灵长类动物实验中效果显著，并且在两位在西非感染埃博拉病毒的美国医务人员和一位西班牙传教士的治疗中使用，其中2 名美国患者的临床症状得以改善，西班牙患者死亡。然而，目前不能确定是否因为使用ZMapp 而使2 位美国患者康复，其安全性和有效性尚待进一步临床试验验证。同时，ZMapp 的供应量有限，规模化生产虽处于准备阶段，仍需时间。此外，人鼠嵌合单克隆抗体（c13C6，h-13F6 和c6D8）的混合株MB-003，可以对恒河猴发挥有效的保护作用，但尚未在人类证实有效。

另外，TKM-Ebola 是一种基因治疗药物，属siRNA，专门针对埃博拉病毒相关基因VP24 和VP35、RNA 依赖的RNA 聚合酶，通过RNA干扰，使得相关蛋白的RNA 被沉默封闭，达到阻止病毒增殖的目的。目前正处于临床I期试验。基于RNA的治疗，目前主要针对扎伊尔型埃博拉病毒，在啮齿类和非人类灵长类动物有效。该方法需要限定特定型别的埃博拉病毒，但暴发早期常无法确定病毒型别。另外，这类药物主要经静脉给药，对于偏远地区的治疗面临物流的挑战。输注患者恢复期血浆提供中和抗体的治疗，尚未取得满意疗效，或有助于减轻病毒载量，若结合其他治疗方式，或许有效。

3.3 支持疗法

在非人灵长类动物感染扎伊尔型埃博拉病毒的实验中，使用源于丝虫的抗凝蛋白rNAPc2，可提供33%的有效性。rNAPc2 主要作用于外源性凝血途径。研究表明，活化蛋白C 在恒河猴中的保护作用与rNAPc2 一致。该类药物已经获批用于临床，可在应急处置时贮备。

4 疫苗研发进展

过去数10年，埃博拉疫情多次暴发流行，因仅限于非洲大陆，其疫苗研发速度受限。截至目前，尚无批准上市的疫苗。开展针对候选疫苗有效性的实验，至少需要2个动物模型，其中1个必须为非人类灵长类动物模型。因此，目前少有候选疫苗能满足此要求，进入临床试验阶段。目前处于研发中的“有希望疫苗”主要分两类：一类是复制缺陷型疫苗，安全性好，有些已在动物实验和I期临床试验中显示良好的效力和免疫原性，但诱导免疫的时间较长，适合暴露前预防使用；另一类是减毒复制型疫苗，存在一定的安全性隐患。例如，以疱疹性口炎病毒为载体的重组疫苗在灵长类动物实验中表现良好，可用于暴发疫情处置和生物恐怖袭击应对。随疫苗研发技术改进，腺病毒Ad5 亚型载体疫苗携有重组的扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白的复制缺陷疫苗，仅需一次免疫。当然，使用该类疫苗要区分病毒型别，因不同型别之间少有交叉反应。未来，至少包含3 种成分的多价丝状病毒疫苗也有良好应用前景。同属于该类疫苗的第2个研发方案是共表达基质蛋白VP40、核蛋白和糖蛋白的病毒样颗粒。该方案有效克服疫苗安全隐患，但需佐剂和加强免疫，不适合在疫情应急处置中使用。另外，该疫苗的费用和生产存在一些挑战，虽然可借反向遗传技术缓解生产压力，但会带来新的安全隐患。

通常而言，减毒复制型疫苗比复制缺陷型疫苗引发免疫应答的效果更显著，易于生产且能刺激天然和获得性（体液和细胞）免疫应答。然而，该原则并不适用于埃博拉病毒，因为在确认活疫苗的安全性上有一定难度。减毒复制型疫苗是基于弱毒的病毒载体制备而成，如疱疹性口炎病毒、副流感病毒载体。尽管已在动物，包括免疫缺陷动物实验中取得良好记录，但这些疫苗均存在安全隐患。对于腺病毒载体，采用人副流感病毒的方法或许存在预存免疫的问题。目前对抗体反应、T 细胞增殖、细胞毒性T 细胞研究显示，抗体和辅助性T 细胞记忆是介导保护性免疫应答必要的；细胞介导的免疫应答尽管重要，但并非必需。针对几种疫苗的临床前评价也在进行中，由美国NIH 支持的一种疫苗，正在等待FDA 进入临床实验的审批，有望在2014 秋天进入I期临床试验。该腺病毒载体疫苗，包含2个埃博拉病毒糖蛋白插入基因片段，已开展了黑猩猩动物实验。另外2 种包含疱疹性口炎病毒假型病毒的疫苗，其中一种候选疫苗的临床试验，将于2015年早期进行。

5 未来研究方向

针对免疫病理和致病机制开展深入研究，将有利于未来疫苗和治疗药物的开发和研制。埃博拉病毒如何下调免疫应答的机制值得深入研究，如何介导淋巴细胞凋亡，病毒如何损害抗原呈递细胞加工抗原的能力？特别是处于获得性免疫应答核心环节的树突状细胞，埃博拉病毒增殖过程中是否对于不同发育阶段的树突状细胞有所选择？病毒对于血管内皮细胞直接损伤具体机制如何？目前的疫苗研究，主要限于扎伊尔型埃博拉病毒，缺乏其他型别的研究，并且集中于非人灵长类动物实验。未来应继续深入探讨候选疫苗针对其他型别埃博拉病毒的是否存在差异。未来还需要开展深入细致的实验动物的病原学研究，为制定干预措施提供靶标。同时，有希望的治疗方案和疫苗应向临床实验推进，并为应急处置，如实验室暴露提供储备。●