细粒棘球绦虫锌指蛋白基因的克隆、序列分析及在不同发育阶段的表达分析

徐梦飞，卢平萍，马 勋，张艳艳，王炜烨,，孟季蒙，王正荣，薄新文

(1.石河子大学 动物科技学院，新疆石河子 832000； 2.新疆农垦科学院 畜牧兽医研究所，省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆石河子 832000)

包虫病(Hydatidosis)又称棘球蚴病，是由(Echinococcusgranulosus)E.granulosus中绦期幼虫--棘球蚴寄生于宿主肝、肺等器官而引发的一种地方性、自然疫源性人畜共患囊型寄生虫病。当E.granulosus虫卵进入中间宿主(牛、羊等食草动物和人)体内后，六钩蚴在其肠内孵出，钻入肠壁，经血液循环至肝、肺等器官，随后发育成棘球蚴，在中间宿主体内长期寄生，对宿主造成机械性损伤。中国是世界上包虫病高发国家之一，包虫病是中国规划防治的五大寄生虫病之一,分别在2012和2016年被列入 《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》和《全国包虫病等重点寄生虫防治规划(2016-2020年)》，其主要流行区在中国西部和北部广大农牧地区，即新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏、内蒙古和四川7省区[1]。包虫病严重危害动物养殖和人类的健康，给畜牧业生产带来巨大损失，严重制约畜牧业的发展。

锌指蛋白指含有通过结合Zn2+稳定的短的可以自我折叠形成“手指”结构的一类蛋白质。锌指结构指在调节蛋白的氨基酸序列中，含有若干Cys残基的依赖锌的核酸结合域，并通过结合锌离子自我折叠形成短而稳定的手指样结构[2]。根据锌指蛋白保守结构域的不同，锌指蛋白可分为C2H2、C4、C6、C4HC3、C3HC4、C2HC、C3H及联合型等多种类型[3]。在真核生物中，锌指蛋白表达广泛，参与多种重要生命过程，具有广泛的生物学功能，如DNA识别，RNA包装、转录及转录后调控，蛋白折叠与装配，脂质结合，并在肿瘤形成和机体免疫干预等生命过程中起作用[3-4]。随研究深入，不断有新的发现，通过设计人工锌指蛋白研究目的基因的表达调控及与核酸、蛋白质的相互作用，有望应用于基因治疗和药物设计[5-6]。本研究从前期对细粒棘球绦虫原头蚴转录组的测序结果中筛选出Eg-ZFP全长cDNA序列，通过生物信息学软件对Eg-ZFP的结构和功能进行预测和分析，并通过qPCR和WISH对其在原头蚴及成虫的表达情况进行初步研究，为疫苗筛选、诊断靶标和药物设计研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细粒棘球绦虫原头蚴、成虫 细粒棘球蚴包囊采自新疆石河子市屠宰场，在无菌条件下，使用一次性注射器刺入包囊进行反复吹打抽取包囊液，待囊液中的原头蚴自然沉淀后，弃去多余的囊液，使用生理盐水和PBS对分离的PSC(原头虫幼)进行3次清洗，获得PSC。

试验所用E.granulosus成虫由省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室提供。

1.1.2 主要试剂与仪器 TRIzol、超纯RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒购自康为世纪(CWBIO)生物科技有限公司；pMD19-T载体、T4连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ购自大连宝生物工程有限公司；E.coliDH5α，购自北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司；质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根(TIANGEN)生化科技(北京)有限公司；罗氏LightCycler○R96 全自动荧光定量PCR仪及相关用品购自罗氏(Roche)诊断产品(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 Eg-ZFP基因的克隆 使用Primer Premier 5.0对Eg-ZFP的编码基因设计特异性引物，F：5′-ATGCTTCCAAGCAGTAAACAG-3′，R：5′-TTATTGAAGAGGACTGTCCATT-3′，(下划线分别为BhmⅠ与XhoⅠ的酶切位点)，引物由上海生工生物工程(上海)有限公司合成。

取PSC和成虫分别置于1.5 mL的EP管中，按超纯RNA提取试剂盒步骤操作，提取RNA，按RNA反转录试剂盒说明书进行cDNA第1链的合成。

以原头蚴cDNA为模板进行Eg-ZFP编码基因的扩增，并用10 g/L，琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收后克隆至pMD19-T，获得pMD19-ZFP重组质粒，转化至DH5α，进行菌液PCR检测，提取质粒，利用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后，送至英潍捷基(invitrogen)测序。测序结果利用BLAST进行序列比对。

1.2.2 生物信息学分析Eg-ZFP基因序列全长筛选自石河子大学动物科技学院寄生虫学和寄生虫病课题组前期PSC转录组测序数据。从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)公共数据库中获取到Eg-ZFP(GenBank ID: CDS15637.1)的氨基酸序列。利用ExPASy系统中的ProtParam数据库(https://web.expasy.org/protparam/)对Eg-ZFP理化性质进行预测。使用DNAStar 软件对该蛋白的亲水性、柔性区域抗原性指数和表面可及性进行预测。使用在线预测软件IEDB(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)和ABCpredABCpred 在线软件(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred /)对Eg-ZFP的B细胞表位进行预测，为提高预测准确性，ABCpred 只保留得分>0.8的结果，IEDB 软件预测结果中只保留长度>7的结果[7]。利用在线预测软件SYPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitopeprediction.htm)和DNAStar软件中的Rothbard-Tayloy法对Eg-ZFP的T细胞表位进行预测。使用ExPASy系统中的SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对Eg-ZFP的二级结构进行预测。通过在线预测软件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对Eg-ZFP的三级结构进行预测。使用软件Euk-mPLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)对Eg-ZFP的亚细胞定位进行预测。由MEGA 7软件构建Neighbor Joining系统发育树。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测 从-80 ℃样品保存箱中取出在TRIzol中保存的细粒棘球绦虫原头蚴、成虫，按照RNA提取试剂盒操作说明提取RNA，使用RNA反转录试剂盒合成cDNA第1链。

选择细粒棘球绦虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(NM_017008.4)作为内参基因，使用Primer Premier 6设计qPCR引物，见表1。反应体系为20 μL，其中SYBR GREEN MIX为10 μL，上、下游引物各0.2 μL，DNA模板1 μL，用无DNA酶水补至20 μL。每个样品设计 3 个生物学重复。反应条件： 95 ℃预变性600 s；95 ℃变性 30 s，58 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 30 s，共45个循环；以4.4 ℃/s的速度进行熔解曲线分析，2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1 荧光定量PCR引物序列Table 1 Fluorescent quantitative PCR primer sequences

1.2.4 荧光原位杂交检测Eg-ZFPmRNA探针试剂盒购自广州外显子生物技术有限公司。取原头蚴和成虫进行WISH。按照王正荣等[8]优化后的WISH步骤对样品进行检测。

1.2.5 数据处理 使用SPSS 24.0对荧光定量PCR数据进行处理，计量资料均采用“平均值±标准差”表示，组间差异比较采用方差分析，样本的两两比较采用SNK法进行检验。使用 GranphPad 6进行作图。

2 结果与分析

2.1 Eg-ZFP基因克隆

PCR产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测可见约 852 bp处有 1 条特异性条带(图1-A)，将 PCR 产物回收后与 pMD-19T连接，将重组质粒转化至 DH5α，摇菌，进行菌液 PCR，可见大小约为 852 bp 的目的条带(图1-B)，对重组质粒进行双酶切，得到852 bp 的目的条带和2 800 bp的载体片段(图1-C)，与预期大小一致。

A.Eg-ZFP基因PCR扩增结果 PCR amplification of Eg-ZFP gene; B.Eg-ZFP重组菌液PCR扩增 Amplification of Eg-ZFP recombinant bacteria; C.pMD-ZFP重组质粒酶切鉴定 Identification of digestion of recombinant plasmid pMD-ZFP

2.2 Eg-ZFP序列分析

2.2.1 蛋白质的理化性质 通过ExPASy的ProtParam数据库对该蛋白的理化性质进行预测，推测该蛋白的分子质量为31.6 ku，等电点(pI)为 8.89。该蛋白在液体中的不稳定系数为 48.35(>40)，为不稳定蛋白。

使用 DNAStar 软件中的 Kyte-Doolittle、Karplus-Schulz、Jameson-Wolf 和 Plot-Emini分别对该蛋白的亲水性、柔性区域、抗原性指数和表面可及性进行预测(图 2)。其中 Kyte-Doolittle 法预测该蛋白的亲水性得分较高的区域为：12～20、29～51和 93～104；Karplus-Schulz 对该蛋白的柔性区域进行分析，Eg-ZFP可塑性较强的区域为：47～71、75～90、104～114、119～133、181～188、256～268 和 273～280；利用 Jameson-Wolf 对 Eg-ZFP 的抗原性指数进行预测，其中得分较高的表位区域为：2～9、19～26、55～71、80～92、120～131、181～189、209～216、227～333和 248～282；Plot-Emini 分析 Eg-ZFP 的表面可及性，得分较高的区域有：56～71、119～130、181～188、209～213 和 254～265。综合以上参数可知，Eg-ZFP总体呈亲水性，可塑性较强，抗原性指数高，表面可及性较好，利于该蛋白重组表达。

图2 DNAStar软件预测Eg-ZFP的亲水性、柔性区域、抗原性指数和表面可及性参数Fig.2 The parameters of hydrophilicity,flexible areas,antigenic index,surface probability of Eg-ZFP using DNAStar analysis

2.2.2 B细胞表位预测 抗原表位又称为抗原决定簇，是抗原分子表面具有特殊结构和免疫活性的化学基团，可刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞[9]。通过在线预测软件ABCpred，得到可能形成B细胞线性表位的氨基酸序列区域为34～49、49～64、63～78、78～93、101～116、169～184、217～232、249～264、258～273和266～281；使用IEDB对Eg-ZFP的B细胞表位进行预测，预测的区域为1～7、25～28、50～93、99～134、139～140、184～187、209～210、226～231和239～244。综合两者的预测区域，两者重叠区域可能形成B细胞线性表位的氨基酸序列为63～78、78～93、101～116和217～232。

2.2.3 T细胞表位预测 使用AMPHI进行T细胞表位预测，可能形成T细胞表位的区域有9～19、55～61、79～82、94～98、125～129、130～140、146～154、155～162、168～170、189～191、218～221、239～147和153～260；Rothbard-Taylor预测可能形成T淋巴细胞抗原表位的区域为8～19、53～57、90～54、96～99、120～124、142～147、163～167、180～184、190～194、208～212、214～218、220～224、243～247、270～273。两者重叠区即可能的优势性T细胞表位区域为9～19、55～57、96～98、146～147和190～191。

2.2.4 二、三级结构 使用在线预测软件SOPMA对Eg-ZFP的二级结构进行分析(图3)，得出该蛋白二级结构中α-螺旋占28.27%，β-折叠占16.96%，β转角占8.48%，无规则卷曲占46.29%。

图3 SOPMA预测Eg-ZFP二级结构Fig.3 Secondary structure of Eg-ZFP predicted by SOPMA

通过SWISS-MODEL在线软件对Eg-ZFP的三级结构进行预测，可见 2 个Zn2+结合位点(图4)。

2.2.5 亚细胞定位 通过在线预测软件Euk-mPLoc 2.0对Eg-ZFP的亚细胞定位进行预测，Eg-ZFP可能在细胞核中发挥作用。

2.2.6 Eg-ZFP氨基酸序列的多重分析 由表 2 可知，将Eg-ZFP同其他物种的ZFP进行序列比对，结果显示Eg-ZFP氨基酸序列与多房棘球绦虫具有很高的同源性(99%)，与人和犬同源程 度较低(30% 左右)(牛、羊的锌指蛋白氨基酸序列不完整，未参与比对)。

图4 SWISS-MODEL预测Eg-ZFP三级结构Fig.4 Tertiary structure of Eg-ZFP predicted by SWISS-MODEL

使用MEGA软件构建Neighbor Joining系统进化树(图5)。从图中可以看出，Eg-ZFP和多房棘球绦虫亲缘关系最近，与其他扁形动物门寄生虫属于同一分支，人和犬属于其他分支。

表2 细粒棘球绦虫与其他物种间锌指蛋白氨基酸序列同源性分析Table 2 Homologous of amino acid ofEg-ZFP with other species

图5 MEGA7软件构建Eg-ZFP的分子进化树Fig.5 Molecular evolution tree of the Eg-ZFP using MEGA7 analysis

2.3 Eg-ZFP在不同阶段的表达

采用相对定量法进行荧光定量 PCR(图 6)，结果显示，溶解曲线出现单一的尖而窄的主峰，说明无非特异性扩增。通过 2-ΔΔCT对原头蚴与成虫的Eg-ZFP表达量进行计算发现，随着E.granulosus的发育，Eg-ZFP在虫体组织中的表达量上升，成虫组是原头蚴组的 2.4 倍(P<0.01)。

2.4 Eg-ZFP mRNA在虫体的组织定位

WISH结果表明，Eg-ZFPmRNA在原头蚴及成虫组织中均有分布。在原头蚴中，分布在内部及顶突钩上(图 7)；在成虫中，Eg-ZFPmRNA广泛分布在虫体内部，在孕节及成节中生殖系统丰度较高(图 8)。

3 讨论与结论

锌指蛋白在1983年由诺贝尔奖获得者Klug及其同事第一次在非洲爪蟾的卵母细胞的转录因子TFⅢA中被发现，此后，大量含有锌指结构的蛋白质被发现，统称为锌指蛋白[10]。锌指蛋白参与动植物的多种生理生化过程，并起重要作用，在奶牛、水稻、秀丽隐杆线虫、旋毛虫等多种生物中陆续有报道[11-14]，但E.granulosus鲜见报道。E.granulosus是重要的人畜共患病之一，给人类健康和畜牧业发展带来巨大的损害，特别是包虫病的治疗仍然比较困难，因此，运用新的方法开发 新的防治措施，有助于消除包虫病对人类健康的危害，锌指蛋白的研究可能用于包虫病防治。本研究成功地对Eg-ZFP基因进行克隆鉴定，使用生物信息学技术对Eg-ZFP的理化性质、结构、功能进行预测和分析，并在不同发育阶段通过qPCR及WISH对Eg-ZFP基因进行分析。

图6 E.granulosus不同发育阶段 Eg-ZFP mRNA的相对表达量Fig.6 The relative expression of Eg-ZFP mRNA in different stages of E.granulosus

A.Merge通道 Merge channel; B.PI通道 PI channel; C.FITC通道 FITC channel; a.实质 Parenchyma; b.排泄沟 Excretory canal; c.顶突钩 Rostellum hook

A.Merge通道 Merge channel; B.PI通道 PI channel; C.FITC通道 FITC channel; a.头节 Scolex; b.幼节 Taenia larvae; c.成节 Mature proglottid; d.孕节 Gravid proglottid

3.1 Eg-ZFP基因克隆及序列分析

本研究结果表明，编码该蛋白的基因全长为852 bp，该蛋白的氨基酸序列全长为283 aa，蛋白分子质量理论预测值为31.6 ku，等电点为8.89。该蛋白总体呈亲水性，亚细胞定位于细胞核，这将有助于采用合理的方法对其进行克隆和表达，获得活性重组蛋白。预测发现该蛋白没有信号肽和跨膜区。二级结构预测表明，该蛋白氨基酸序列中包含有10个优势性抗原表位，表明该蛋白具有较好的抗原性，符合寄生虫免疫学诊断和免疫防治候选基因的特点，推测该蛋白可作为免疫候选分子，且该蛋白中β-转角和无规则卷曲占54.77%，两者的结构常盘旋、扭曲并在蛋白表面展示，可促进抗体结合和B细胞抗原表位的形成[14]。三级结构预测显示，该蛋白含有2个锌离子结合位点，含有“手指”结构，说明该蛋白为锌指蛋白，并且通过分析与锌离子结合的保守性氨基酸残基的组合可以发现，该蛋白属于C2H2型的锌指蛋白，即经典型锌指，该型锌指蛋白在与核酸发生相互作用时多以单体形式，是目前研究最多最广泛的一类锌指，小鼠转录因子Zif268和人类转录因子SP1都属于这类蛋白，其中SP1主要通过调控富含GC启动子的基因表达，参与调节细胞功能，如细胞复制、凋亡、分化及肿瘤形成[5,15-18]；在植物中，相关研究发现多种与植物胁迫耐受相关的植物C2H2型锌指蛋白，在拟南芥中的STZ基因，矮牵牛中的ZPT2-3基因，水稻中的RZF71基因、RZF5基因等，这类基因能够提高植物对胁迫的耐受能力，此类研究对利用转基因技术提高植物对逆境的耐受能力提供依据[19-20]；在寄生虫领域，在水稻干尖线虫锌指蛋白的研究中，锌指蛋白在生殖代谢路径中起重要作用[21]，在旋毛虫中发现，FYVE锌指结构域在多种蛋白中被发现，如具有信号传导、脂质小泡转运节细胞骨架调节等功能的蛋白[22-23]。

3.2 Eg-ZFP氨基酸序列比对分析

本研究通过对Eg-ZFP氨基酸序列进行比对发现，Eg-ZFP基因和多房棘球绦虫亲缘性最近，达到99%，其次是曼氏血吸虫，为60% 相似性，而与人和犬的同源性相距较远；进化树分析同样表明，人和犬与E.granulosus处于不同的分支，进化关系较远，推测Eg-ZFP可作为诊断的候选分子。

3.3 Eg-ZFP mRNA不同发育阶段检测

qPCR结果表明，Eg-ZFP基因在细粒棘球绦虫的原头蚴和成虫阶段都有表达，并且成虫的表达量是原头蚴的2.4倍，说明Eg-ZFP在细粒棘球绦虫生长发育过程中起重要作用。WISH结果表明，在原头蚴中Eg-ZFPmRNA主要在顶突处分布较集中，在成虫中主要在孕节中的生殖系统中分布较集中，再次表明Eg-ZFP可能在E.granulosus生殖和发育过程中发挥作用，与刘晓晗等[20]在水稻干尖线虫中的锌指蛋白功能相似，为针对以锌指蛋白为靶点设计相应的药物控制或抑制E.granulosus的生殖与发育提供新的思路，结合Eg-ZFP生物信息学分析的结果，提示将Eg-ZFP作为疫苗和诊断候选分子，可能在中间宿主及终末宿主进行免疫及诊断中均能发挥作用。

本研究对Eg-ZFP基因进行克隆及序列分析，运用qPCR及WISH分别对Eg-ZFP在mRNA水平的转录情况进行检测，结果表明，Eg-ZFP有望成为疫苗及诊断候选分子，并且Eg-ZFP在E.granulosus的生长发育中起重要作用，以此设计药物抑制Eg-ZFP基因的表达，将对E.granulosus的生殖和发育产生影响，从而达到防治的作用。