ATR-FTIR在小麦及其制品呕吐毒素污染水平快速测定中的应用

沈 飞，刘 潇，裴 斐，李 彭，姜大峰，刘 琴

（1.江苏高校现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210023；2.山东省疾病预防控制中心，山东 济南 250014）

小麦是我国主要的粮食作物，小麦及其制品的品质优劣对于食品安全至关重要。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又称呕吐毒素，是主要由小麦赤霉病菌产生的单端孢霉烯族毒素，可引起人畜中毒、代谢紊乱，有明显的致突性、致癌性[1]。近年来，小麦赤霉病在我国大规模爆发越来越频繁，尤其对冬麦主产区造成重大危害，其产生的DON污染已成为小麦减产和品量变差的重要原因。加强小麦DON污染的风险监测是控制其危害的前提。目前，DON检测方法有薄层层析法[2]、高效液相色谱法[3]、气相色谱-质谱联用法[4]、液相色谱-质谱联用法[5]和酶联免疫吸附法[6]等。这些方法检测的准确度普遍较高，但过程均较为复杂繁琐，不能满足现场实际检测需求。因此，开发一种快速、准确的小麦及其制品DON污染检测方法，对于建立健全DON污染监测体系，维护食品安全和人民身心健康十分必要。

衰减全反射-傅里叶红外光谱（attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）是一种分子振动光谱技术，它无需对样品进行复杂的预处理，能够快速获得样品的光谱指纹特征，已成功用于食用油[7-8]、水果[9-12]、肉类[13-15]等食品/农产品的品质与安全检测中。在小麦及其制品研究方面，Kos等[16]利用ATR-FTIR对受DON污染的玉米进行分析，结果表明DON含量在0.13～8.23 mg/kg范围内时，判别正确率为75%。Girolamo等[17]通过分析找到了DON所对应的特征波长，通过定性预判模型和偏最小二乘（partial least squares，PLS）法模型能够判断出小麦中DON含量的高低，但是该模型只适合于特定的小麦。关二旗等[18]利用近红外光谱获取赤霉病小麦碎粒和未感病小麦籽粒的近红外光谱数据信息，构建了SIMCA模型，实现了小麦赤霉病粒的准确识别。但该研究中样品量较小，结果还需要进一步验证。综上可知，应用光谱技术，尤其是ATRFTIR检测小麦DON污染的研究还较为有限，对象多以小麦原粮为主，且主要集中在定性判别上。

本研究拟进一步探索不同样品基质条件下ATR-FTIR技术的应用潜力，建立小麦、面粉以及面粉制品中DON污染的快速分析方法和模型，为实现小麦DON污染的快速、准确监测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从农户、粮库和超市等处搜集小麦（34 份）、面粉（34 份）以及饼干、面包等面粉制品（30 份）样品，共98份。将收集的样品全部磨成粉并过20 目筛，以保持样品检测状态的一致性，放于4 ℃备用。

DON标准品（纯度＞99.5%） 美国Sigma公司；超纯水（电阻≥18.2 MΩ）；乙腈、甲醇（均为色谱纯）；其他所用试剂均为色谱纯或分析纯。

1.2 仪器与设备

Tensor27型FTIR仪 德国Bruker公司；ZnSe ATR附件 美国Pike公司。

1.3 方法

1.3.1 ATR-FTIR测量

将冷藏样品置于室温（23±1）℃平衡2 h，运用FTIR仪和ZnSe ATR附件（采集样品的光谱信息。用天平称取1 g粉末样品放于ATR 附件的ZnSe晶体上，以空气背景进行检测，扫描波数范围4 000～600 cm－1，分辨率4 cm－1，扫描64 次，样品重复扫描3次，取平均值作为样品的光谱数据[19]。

1.3.2 DON含量测定

样品中DON含量的测定综合参考罗颖鹏[3]、王丽娟[20]等的方法，将所有样品清杂后用粉碎机全部粉碎成粉（过20 目筛），准确称取25.0 g样品到250 mL锥形瓶中，加入100 mL乙腈-水（84∶16，V/V）溶液，涡旋混匀1 min，振荡提取30 min，在 10 000 r/min离心10 min，取上清液过MycoSep226净化柱净化。弃掉最先流出的2 mL净化液，取5 mL净化液40 ℃氮气流吹干，残余物用1 mL含0.2%氨水的乙腈-水（10∶90，V/V）复溶，涡旋30 s。再用0.22 μm有机滤膜过滤，2 mL进样瓶收集滤液，高效液相色谱-质谱测定。该方法的检出限为1 μg/kg，样品的加标回收率为89.8%～107.96%。

1.4 数据分析

数据处理软件采用TQ Analyst v 8.6.12（Thermo Electron 公司，美国）软件。运用偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析和逐步多元性回归（stepwise multiple linear regression，SMLR）分析方法建立DON毒素定量预测模型，自变量为样品的中红外光谱信息，因变量为样品中DON毒素含量，随机地选取样品的2/3作为建模集，1/3作为验证集。为消除来自高频随机噪声、基线漂移、样本不均匀等对建模带来的影响，采用多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）以获得较好的预测效果，在建模过程中采用留一交互验证的方法保证模型的稳健性[21]。用模型决定系数（correlation coefficient of determination，R2）、建模均方根误差（root mean squared error of calibration，RMSEC）、预测均方根误差（root mean squared error of prediction，RMSEP）、交互验证均方根误差（root mean squared error of cross validation，RMSECV）和相对分析偏差（residual predictive deviation，RPD）[22]以及模型检测限[23]等指标对模型性能进行评价。

2 结果与分析

2.1 ATR-FTIR分析

图1 不同DON含量样品的中FTIR图Fig.1 FTIR spectra of samples with different DON contents

小麦赤霉病主要是由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、黄色镰刀菌（F. culmorum）和串珠镰刀菌（F. moniliforme）等镰刀菌感染引起的[24]，而镰刀菌所产毒素主要为DON。研究表明[25]由于镰刀菌的呼吸作用会分解大分子物质，当小麦中DON含量增加时，淀粉、蛋白质和脂肪会发生不同程度的变化，同时镰刀菌产生的DON会进入淀粉和蛋白质中从而导致淀粉和蛋白质之间的结合变疏松，进而导致粗淀粉和粗蛋白的含量降低；镰刀菌的生长需要消耗能量，同时导致脂肪的氧化，故粗脂肪的含量逐渐下降，脂肪酸值在逐渐上升[26]。

检测结果显示，9 8 份样品中D O N的含量在0.02～4.53 mg/kg之间，平均值为1.93 mg/kg。图1a为不同DON含量小麦的ATR-FTIR的光谱图，整体来看，样品在4 000～600 cm－1范围内的中红外谱图比较相似，存在较多的共同谱峰。DON含量低的样品的吸收值总体上略高于DON含量高的样品。由图1b可知，在1 740 cm－1处DON含量低的样品的吸收值明显高于DON含量高的样品，镰刀菌在产DON毒素的过程中能够促进脂肪的氧化，从而使得脂肪酸值上升；在1 648 cm－1（酰胺I）和1 549 cm－1（酰胺II）处有较明显的吸收峰且DON含量高的样品吸收值要高于含量低的，这主要是由于黄色镰刀菌产生的蛋白酶能够水解小麦中的蛋白质生成氨基酸[27-28]。在1 300～900 cm－1波数处主要是由淀粉吸收键的振动引起的，镰刀菌在产DON毒素的过程中需要消耗能量，主要是通过水解淀粉等糖类物质为其生长代谢提供能量[29]。分析发现，样品在1 900～900 cm－1波段范围内光谱差异较为显著，因此用于后续分析。

2.2 PLSR建模分析

在PLSR分析过程中，为了进一步对获取光谱进行分析，对所有样品的前3 个PLS因子的潜变量（latent variable，LV）进行权重分析，结果如图2所示。LV1的最高权重位于1 745、1 657、1 475 cm－1和1 180 cm－1处，主要由脂质、脂肪酸和蛋白质引起的。镰刀菌产DON过程中，样品中的脂肪氧化产生脂肪酸，由于脂肪酸中C=O的对称伸缩振动导致光谱在1 745 cm－1出现较强的峰；其中氨基酸中的COO的伸缩振动会在1 600～1 555 cm－1附近出现较强的吸收带，蛋白质分子中的—CO—NH—基团的C—N伸缩振动和C—N—H的面内弯曲振动之间产生耦合，分别在1 640 cm－1和1 540 cm－1附近出现特征峰。LV2最高权重位于984 cm－1处，主要是由糖类引起的；LV3的最高权重位于1 545、1 385、1 088、1 046 cm－1和989 cm－1处，主要是由脂质、蛋白质及糖类引起的。由于糖类中含有多个的C—OH，而C—OH伸缩振动会使光谱在1 100～1 000 cm－1附近出现多个吸收峰[30-31]。

图2 用于DON分析的PLSR模型前3 个因子的权重光谱Fig.2 Loading spectra of the first three factors for DON analysis by PLSR model

利用PLSR对小麦及其制品中DON含量进行预测分析，从而判断小麦及其制品的食用安全状况。利用ATRFTIR对DON毒素含量进行建模时，采用4 种不同的预处理方法对采集的原始光谱进行处理，结果如表1所示，仅用MSC预处理光谱时，可获得较高的RC2和较低的RMSEC，且RMSECV与RMSEP值均较小。此外，RPD值在2～2.5之间说明模型具有定量预测的潜能，在2.5～3之间说明模型用于定量分析，大于3时，表示模型预测精度高、可用于实际定量分析[32]。如表1所示，MSC预处理PLSR模型的RPD值达到2.6，定量分析的检测限为1.435 mg/kg，表明模型在快速筛分及定量检测方面具有一定的实际应用潜力。

表1 小麦及其制品中DON含量的PLSR定量分析结果Table1 PLSR prediction of DON contamination in wheat and its products

2.3 SMLR建模分析

表2 小麦及其制品中DON含量的SMLR定量分析结果Table2 SMLR prediction of DON contamination in wheat and its products

SMLR可以对自变量进行筛选，剔除不具备显著性意义的变量，从而确定一个最佳的线性回归方程。利用SMLR进行预测分析时分别选择7、9、11 个和13 个波段数进行分析，分析前运用MSC对光谱进行预处理，结果如表2所示。结果表明，建模时所选取波段中有些与DON产生有关，有些与DON的产生存在间接的联系。在所选的13 个波段中，1 537、1 562、1 600、1 680 cm－1和1 677 cm－1均是蛋白质的特征吸收峰；1 525、1 507 cm－1和1 479 cm－1为脂肪的特征吸收峰；1 073、1 083 cm－1和1 027 cm－1处为淀粉的特征吸收峰；1 785 cm－1为脂肪酸特征吸收峰；而1 824 cm－1吸收值很小，可能为噪声等杂峰。而DON的产生主要与淀粉、蛋白质和脂肪相关，所以通过波段的选择可以提高预测结果的准确性。建模结果显示，所选波段数为9 个和13 个时，建模效果较其他两组要好。评价预测模型的优劣主要是通过、RMSEP值评价，通过对比发现在选取9 个和13 个波段进行预测时效果较好。通过斜率和截距的大小也能反映出线性模型效果的优劣，斜率越接近1，截距越接近0表明线性相关性越好。对比9 个波段和13 个波段的结果发现，选取9 个波段进行分析时相关性较好，斜率和截距分别为0.940 2和0.166 6，此时模型的RPD值为2.6，检测限为1.50 mg/kg。

图3 小麦及其制品DON毒素含量的PLSR（a）和SMLR（b）模型预测结果图Fig.3 Predictive models for wheat and its products by PLSR (a) and SMLR (b)

利用PLSR和SMLR对小麦、面粉以及小麦制品建立分析预测模型。全部样品的PLSR模型预测结果见图3a，所有样品都分布于中心线两侧，共8 个因子用于计算，预测集的值为0.86，RMSECV与RPD值分别为0.507 mg/kg、2.6。图3b为选取9 个波段时的SMLR模型，预测集的值为0.86，RMSECV与RPD值分别为0.495 mg/kg、2.6，预测结果显示通过PLSR和SMLR建模可预测小麦、面粉及其他小麦制品中的DON含量。

PLSR是对全光谱进行建模分析的，数据矩阵分解和回归交互结合，得到的特征向量直接与样品性质相关，故所建模型一般较为稳健。但由于选取的光谱范围内存在干扰峰并且存在低含量的样品预测误差大的缺点，所以实际应用时利用PLSR模型对DON低于其检测限的样品进行分析时的效果可能不佳。SMLR是随机选取多个谱带进行分析，在分析的过程中将干扰峰和噪音峰剔除，但由于选择谱带的随机性，有些谱带与DON的产生存在直接的关系，有些则无关，所以可能导致模型预测性能下降。

3 结 论

本研究表明ATR-FTIR技术可作为一种快速分析方法，评估小麦及其制品的DON污染情况。研究表明，不同DON含量样品在1 740、1 648、1 549 cm－1等附近的吸收值存在显著差异，可作为DON定量检测的指纹图谱加以利用。PLSR和SMLR的模型结果预测误差较低，RMSEP分别为0.438 mg/kg和0.426 mg/kg，RPD值均为2.6，具有一定的实际应用潜力。然而，本研究所用样品数量仍较为有限，进一步研究需要补充更多的代表性样品，以不断增强模型的稳健性和适用性。