牛奶源金黄色葡萄球菌血清型、毒力基因及PFGE分型

刘保光，蔡 田，李小申，刘营营，贺丹丹，匡秀华，高延玲，胡功政,

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.河南牧业经济学院制药工程学院，河南 郑州 450046；3.河南省兽药监察所，河南 郑州 450008）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的人兽共患病原菌，是导致食物中毒重要的食源性病原菌，也是造成人和动物感染的主要病原菌之一[1-2]。金黄色葡萄球菌在自然界分布较广泛，如空气、土壤、食品等均可存在。据国外有关报道[3-5]，金黄色葡萄球菌在奶及乳制品等食品中大量存在并广泛流行，生鲜牛奶是金黄色葡萄球菌感染的潜在载体。在中国，金黄色葡萄球菌是引起牛、羊乳房炎的重要病原菌之一，且在牛乳及羊乳中广泛存在[6]。此外，金黄色葡萄球菌能产生大量的毒力因子，主要包括肠毒素、剥脱毒素、中毒休克毒素-1和杀白细胞毒素等，这些毒力因子在金黄色葡萄球菌感染中扮演着重要角色[7]。研究发现，携带肠毒素的金黄色葡萄球菌引起的食物中毒发生、发展比较迅速，对人类的身体健康危害较大，金黄色葡萄球菌携带的肠毒素是导致食源性中毒的主要毒力因子[8]。

目前，金黄色葡萄球菌常用的分型方法主要有多位点序列分型、金黄色葡萄球菌蛋白A、脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）和葡萄球菌盒式染色体mec分型等[9]。其中，PFGE分型被公认为是细菌分型的“金标准”，主要原理是利用金黄色葡萄球菌基因组DNA进行原位酶切，分析菌株间遗传相关性[10]。开展金黄色葡萄球菌PFGE分型，对了解菌株的流行病学分子特征、控制克隆株的传播具有重要的意义。近年来，国内外对金黄色葡萄球菌分离鉴定、耐药性及分子分型报道较为多见[11-13]，对患有奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药性、毒素基因检测方面也有报道[14]，但是，从健康奶牛采集的生鲜牛奶金黄色葡萄球菌荚膜多糖血清型鉴定、耐药性及PFGE分型报道鲜见[15]。

鉴于此，本实验对河南省不同地区健康动物牛奶源金黄色葡萄球菌进行荚膜多糖血清型鉴定、毒力基因检测及PFGE分型研究，旨在阐述该菌携带毒力基因情况及克隆传播的分子特征，为生鲜牛奶的安全评价提供理论依据，为下一步研究耐药机制提供参考，这对加强我国乳及乳品血清型、毒力基因检测及分子分型研究具有重要的理论意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株来源

80 株金黄色葡萄球菌于2014—2015年间采集于河南省不同地区（编号A1～A4）健康动物奶牛养殖场生鲜牛奶样品，沙门菌H9812由河南省兽药监察所惠赠。

1.1.2 培养基

TSA、BHI及LB培养基 北京陆桥技术有限责任公司；金黄色葡萄球菌显色培养基 法国科玛嘉公司。

1.1.3 试剂

内切酶XbaI、SmaI 大连宝生物公司；2×Taq Master Mix、DNA Marker 北京康为世纪有限公司；Agarose L.M.P、蛋白酶K 北京索莱宝有限公司；SeaKem®Gold Agarose金胶琼脂糖 美国Lonza公司。

1.1.4 引物

实验研究所用基因引物，均由上海生物工程有限责任公司合成、测序。

1.2 仪器与设备

高速台式离心机 德国Thermo公司；CHEE MAPPER型PFGE 美国伯乐公司；Gene Genius凝胶成像系统 英国Syngene公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 杭州晶格科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌的分离鉴定

将采集的牛奶样经离心取混匀沉淀物分别接种于BHI琼脂、TSA琼脂及科玛嘉显色培养基[16]，经37 ℃过夜培养，挑单菌落接种于BHI肉汤，涂片染色镜检，并通过VITEK-2系统鉴定。对鉴定后的菌株进行基因组DNA提取（加适量溶菌酶），作为PCR模板。为确证所分离菌株，参考相关报道[17]，利用特异性引物（F：5’-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’；R：5’-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’）进行PCR扩增nuc基因及电泳检测，测序后在NCBI用BLAST比对。金黄色葡萄球菌ATCC 29213为阳性对照菌株。

1.3.2 荚膜多糖血清型鉴定

金黄色葡萄球菌的荚膜多糖是其致病和免疫的基础，据有关研究表明[18]，大概80%金黄色葡萄球菌能产生cap5型或cap8型荚膜多糖，本实验利用（cap5 F：5’-GAAAGTGAACGATTAGTAGAA-3’，cap5 R：5’-GTACGAAGCGTTTTGATAGTT-3’；cap8 F：5’-GTGGGATTTTTGTAGCTTTT-3’，cap8 R：5’-CGCCTCGCTATATGAACTAT-3’）引物对cap基因可变区PCR扩增。

1.3.3 毒力基因测定

对24 种毒力基因（肠毒素、溶血素、杀白细胞毒素、凝集因子、中毒休克毒素和表皮剥脱毒素6 大类）进行PCR扩增[19-23]。PCR体系为20 μL，其中2×Taq Master Mix Premix Taq酶10 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，去离子水6 μL。PCR参数为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30 次，72 ℃延伸8 min。PCR扩增后分别取8 μL产物用1%琼脂糖凝胶电泳。若阳性，进行测序，在NCBI进行BLAST比对。

1.3.4 PFGE分型

1.3.4.1 细菌培养与小胶块制备

金黄色葡萄球菌PFGE的操作参照美国疾病预防控制中心提供的方法[24]，挑取LB板上的单菌落接种于4 mL LB肉汤中，37 ℃过夜培养；收集菌液，10 000 r/min离心2 min，沉淀用200 μL TE缓冲液混匀，调整细菌浊度为1.8～2.4；向200 μL菌悬液加入6 μL溶葡萄球菌素酶（1 mg/mL），37 ℃作用4 h；再加入等体积的60 ℃预热已融化的2%低熔点小胶，轻轻混匀后迅速倒入模具，4 ℃冷却30 min，备用。

1.3.4.2 细菌裂解与酶切

将制备好的小胶块放于2 mL EC细胞裂解液中裂解5 h以上，用TE缓冲液洗涤3～5 次，每次30 min，该过程在摇床缓慢摇，取约2 mm宽的胶条，用TE缓冲液平衡后，加入SmaI内切酶4 μL于37 ℃酶切6 h。沙门菌H9812用XbaI内切酶37 ℃酶切3 h。

1.3.4.3 加样、电泳及图像分析

配制1% SeaKem Gold琼脂糖凝胶，把酶切好的胶条小心放入梳孔中，在空隙中加入融化的琼脂糖凝胶封口，最后用1% SeaKem Gold琼脂糖完全浸没胶条，凝固后将整块胶放入CHEF Mapper电泳仪的缓冲液中电泳。电泳条件：6 V/cm，脉冲时间5～42 s，14 ℃，角度120°，时间19 h。结束后将胶块放入溴化乙锭中染色30 min，蒸馏水清洗10 min，用Bio-Rad凝胶成像系统获取图片，并保存为TIFF格式。

1.4 数据分析

使用BioNumerics软件的UPGMA和Dice参数对图片进行数据分析，得出聚类图。

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定

350 份生鲜牛奶样品经分离培养、显色培养基筛选、nuc基因PCR检测，共得到80 株金黄色葡萄球菌，检出率为22.86%（表1）。河南4 个地区中，来自A1地区的样品分离率最高，为34.9%（30/86）；来自A4地区的样品分离率最低，为12.5%（11/88）。

表1 生鲜牛奶样品中金黄色葡萄球菌的流行Table1 Prevalence of S. aureus isolates from fresh milk

2.2 荚膜多糖血清型鉴定

荚膜多糖血清型鉴定结果发现，80 株金黄色葡萄球菌有70株可以通过荚膜多糖分型。48 株属于cap5血清型（60%，48/80），22 株属于cap8血清型（27.5%，22/80），本实验可见，cap5血清型是流行血清型。

2.3 毒力基因测定结果

如表2所示，本实验中24 种毒力基因，有21 种被检测到，但表皮剥脱毒素基因（eta、etb和etd）未检测到。从80 株金黄色葡萄球菌中共检测到62 株（77.5%）携带有毒力基因，检测率较高。本实验检出率较高的毒力基因有set、hlb、hld、lukED、cna、ebp、clfA和clfB，检出率分别为40.00%（32/80）、51.25%（41/80）、57.50%（46/80）、60.00%（48/80）、47.50%（38/80）、58.75%（47/80）、57.50%（46/80）和58.75%（47/80）。中毒休克毒素（tsst）和杀白细胞毒素（pvl）检出率较低，分别为1.25%（1/80）和2.50%（2/80）。

80 株金黄色葡萄球菌中，携带的毒力基因谱型较为多样化，既有含单个基因的，又有含多个基因的。但是，有47株（58.75%）菌携带不少于6种毒力基因，最常见的毒力基因谱型为set-hla-hlb-hld-lukED-cna-ebp-clfA-clfB（表2）。

表2 金黄色葡萄球菌毒力基因检测结果（n=80）Table2 PCR detection of virulence genes from S. aureus isolates (n= 80)

2.4 PFGE分型

PFGE结果显示，成功获得72 株菌清晰的PFGE图谱（72 株能被SmaI酶切开）。使用BioNumerics分析软件进行聚类，如图1所示，以90%的相似性可将其分为12 个簇（A～L）和46 种PFGE型。其中A簇分为3 种PFGE型（3 株，PFGE1～PFGE3）；B簇分为3 种PFGE型（5 株，PFGE5～PFGE7）；C簇分为2 种PFGE型（2 株，PFGE9、PFGE10）；D簇分为3 种PFGE型（11 株，PFGE11～PFGE13）；E簇仅含有1 种PFGE型（2 株，PFGE14）；F簇仅含有1 种PFGE型（2 株，PFGE17）；G簇分为3 种PFGE型（7 株，PFGE18～PFGE20）；H簇仅含有1 种PFGE型（3 株，PFGE22）；I簇分为5 种PFGE型（7 株，PFGE25～PFGE29）；J簇分为5 种PFGE型（9 株，PFGE30～PFGE34）；K簇分为4 种PFGE型（6 株，PFGE35～PFGE38）；L簇分为3 种PFGE型（3 株，PFGE42～PFGE44）。

PFGE聚类表明，同一地区牛奶源金黄色葡萄球菌主要以克隆方式进行传播，但相同地区菌株呈现的PFGE型别具有多样性的差异。尽管不同地区分离得到的菌株中有个别为相同的克隆型（如B簇、E簇），但是不同地区牛奶中流行的金黄色葡萄球菌的克隆型具有较大的差异。此外，D簇、G簇和J簇的菌株均检出一定基因类型的毒力基因，表明河南地区生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌毒力基因广泛存在于多种PFGE型别中。

图1 金黄色葡萄球菌PFGE图谱聚类分析（n=72）Fig.1 Cluster analysis of PFGE types from S. aureus isolates (n = 72)

3 讨 论

金黄色葡萄球菌是重要的人兽共患病原菌，要求在各类食品不被检出。但本研究结果显示，生鲜牛奶中存在一定程度的金黄色葡萄球菌污染，检出率为22.86%，高于刘冬香等[25]报道的检出率为10.54%，但低于张倩等[26]报道的检出率47.24%。进一步推测可能是与采集的样品地点、样品的数量及采集的年代等有关。此外，本实验利用PCR对金黄色葡萄球菌的nuc基因进行扩增，其检测结果与通过微生物培养鉴定的结果100%符合。近年来，各级政府监管机构对食品安全愈发重视，要求从源头杜绝金黄色葡萄球菌对食品的污染，以降低金黄色葡萄球菌在各类食品中的检出率。

据刘秀丽等[27]报道，金黄色葡萄球菌荚膜多糖被分为11 个血清型，其中cap5型和cap8型为流行血清型，约占临床菌株的70%～80%。Goerke等[18]研究发现，cap8为流行血清型。本实验结果显示，48 株属于cap5血清型（60%，48/80），22 株属于cap8血清型（27.5%，22/80），cap5为流行血清型。

共检测到62 株（77.5%）携带有毒力基因，且携带的毒力基因谱型多样。本实验测定牛奶源中金黄色葡萄球菌的肠毒素基因种类（sea～set）表明，肠毒素基因检出率为90.00%（72/80），检出率最高的为set（40.00%），其次为seb（17.50%）。据赵俊利等[14]报道金黄色葡萄球菌肠毒素基因（sea～seo）检测率为96.2%，携带率最高的为sej（62.26%），其次为sen（49.06%）。据张静等[28]测定原料乳中金黄色葡萄球菌肠毒素基因（sea～sej）研究表明，肠毒素基因检出率为70.45%，检出率最高的为sea（56.82%）。推测这可能与菌株来源、地域性质等有一定关系，也进一步说明不同地区生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素基因的流行不同。据章乐怡等[29]报道传统肠毒素基因（sea～see）占金黄色葡萄球菌引起食物中毒的95%。本研究也检测到传统肠毒素基因（sea～see），进一步说明河南省生鲜牛奶中存在一定的安全隐患，应予以重视。

但是，本研究中，杀白细胞毒素（pvl）的检出率较低，仅为2.50%（2/80），与谢秀兰等[30]报道的检出率34.4%存在较大差异，这说明不同地区pvl的检出率不尽相同，进一步暗示了牛奶等食品中pvl基因的流行可能存在一定的地域差异。携带毒力基因hlb、hld、lukED、ebp、clfA和clfB的菌株均达50%以上，有47 株（58.75%）菌携带多种毒力基因，毒力基因谱型set-hla-hlb-hld-lukED-cna-ebp-clfA-clfB最为常见。这与杨峰等[31]报道含lukED、hlb和hld基因的菌株均达70%以上相吻合。虽毒力基因并不能作为菌株致病的标准，而其潜在的风险应当予以关注。但携带高频的hlb、hld、lukED、ebp、clfA和clfB毒力基因，暗示其在致病性方面具有重要作用。

本研究对牛奶源金黄色葡萄球菌PFGE型别进行分析，建立河南地区牛奶源金黄色葡萄球菌PFGE分型数据库，包含12 个簇和46 种PFGE型。PFGE聚类表明，同一地区的菌株主要以克隆传播进行扩散，且相同地区的菌株呈现的PFGE型别具有多样性。而不同地区菌株又可划分在同一PFGE型别中，如B簇和E簇，表明该型菌株在河南地区不同奶牛场具有一定流行性，这与王桂琴等[32]的报道认为一些菌株呈现相同的PFGE型别能在不同奶牛场流行观点相一致，推测可能存在一定的传播。另外，D簇、G簇和J簇均检出一定基因类型的毒力基因，表明河南地区生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌毒力基因广泛存在于多种PFGE型别中，揭示这几种PFGE型别的流行可能与毒力基因的存在有一定的相关性。此外，本研究发现8株不能被SmaI酶切的菌株，据有关研究报道[33]，这种类型菌株可在动物与人之间传播，具有较大的危害性。