紫胶桐酸对映体的HPLC-ELSD法分离及其手性拆分热力学

李 坤，张雯雯，刘兰香，郑 华，李 凯，徐 涓，张 弘

（中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局特色森林资源工程技术研究中心，云南 昆明 650224）

紫胶是紫胶虫分泌的一种天然树脂混合物[1-2]，主要由紫胶树脂、紫胶蜡和紫胶色素组成[3-5]。紫胶树脂是由紫胶桐酸为代表的羟基脂肪酸和壳脑酸为代表的倍半萜烯酸所组成的内酯与交酯[6-9]。紫胶树脂以其优良的成膜性、黏结力、抗盐雾、耐水等性能而广泛应用在食品、医药、军工、涂料等行业[10-15]。将紫胶树脂中的内酯与交酯键破坏后，经系列提取、纯化工艺即得紫胶桐酸[16-18]。紫胶桐酸，即9,10,16-三羟基十六烷酸，化学式为C16H32O5，是一种白色晶体[19-21]。紫胶桐酸是一种具有重要应用价值的多羟基脂肪酸，目前主要用于香料工业中香猫酮、二氢香猫酮、大环麝香类化合物的合成，亦可作为前列腺素、昆虫信息素、环酰脲等物质的合成原料[22-24]。目前，有关紫胶桐酸的研究大多关注的是其作为化学纯长链羟基脂肪酸本身的价值[25-27]，立体结构及其相关的性质及应用研究则少有涉及。从结构上看，紫胶桐酸9位与10位均为手性羟基，且无中心对称轴，因此理论上存在2 组对映异构体，虽有国外学者注意到了苏式与赤式构型间的部分差异，但研究并未深入[28]。显然，明确紫胶桐酸的立体构型对于促进其深度开发和利用有着重要的理论和现实意义。本实验采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（high performance liquid chromatographyevaporative light-scattering detector，HPLC-ELSD）法，建立紫胶桐酸立体异构体的拆分和检测条件，并从热力学角度探索其手性拆分的机理和规律，以期为光学纯紫胶桐酸的拆分检测和色谱法制备提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

颗粒紫胶 昆明西莱克生物科技有限公司；紫胶桐酸参考文献[16]中方法制备，按照文献[20]方法检测，实际质量分数为96.8%。

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Promptar公司；（±）-紫胶桐酸混旋体标准品（纯度＞95%） 美国Sigma公司；氢氧化钠（分析纯） 西陇化工有限公司；氯化钠（分析纯） 天津风船化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯） 广东光华科技有限公司。

1.2 仪器与设备

1200型HPLC仪、1260B型ELSD 美国安捷伦科技有限公司；色谱柱DAICEL CHIRAL PAK IF（25 cm×0.46 cm i.d.，5 μm） 大赛璐药物手性技术（上海）有限公司；AB204-S精密型电子天平 瑞士梅特勒-托利多（中国）有限公司；DSC200F3差示扫描量热仪 德国Nestch公司；高纯氮气（纯度≥99.999%）、液氮 昆明梅塞尔气体有限公司；Tensor-27傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克公司。

1.3 方法

1.3.1 紫胶桐酸对映体拆分方法的建立

流动相组成：以甲醇、乙腈、水为流动相组分，分别测定流动相组成为0.1%甲酸-甲醇（20∶80，V/V）、0.1%甲酸-乙腈（50∶50，V/V）、乙腈-甲醇（50∶50，V/V）溶液时，紫胶桐酸对映体的手性拆分效果。

流动相比例：根据上述确定的流动相组成，设定流动相比例（V/V）为20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30，根据色谱出峰时间，分别按照文献[29]的方法计算容量因子k1、k2，分离因子α及分离度Rs，以便评价对比拆分效果。

柱温：在上述确定的最佳流动相组成和流动相比例条件下，分别设置柱温为10、15、20、25、30、35、40 ℃，根据出峰时间，分别按照文献[29]的方法计算容量因子k1、k2，分离因子α及分离度Rs，以便评价对比拆分效果。

线性关系考察：配制质量浓度为1.0 mg/mL的紫胶桐酸混旋体贮备液备用。采用稀释法准确配制质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的标准样品。在上述确定的最佳条件下，以峰面积为纵坐标，样品质量浓度为横坐标，分别建立2 个对映体的回归方程，以回归方程系数R2检验2 个对映体在指定质量浓度范围内的线性关系。

重复性考察：配制0.5 mg/mL的混旋体样品，重复进样3 次，分别计算2 个对映体峰的峰面积及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

稳定性考察：配制0.5 mg/mL的混旋体样品，分别在0、4、8、12、24、36、48 h时进样，分别计算2 个对映体峰的峰面积及RSD。

1.3.2 紫胶桐酸对映体含量与ee值测定

在最佳拆分条件下，配制0.5 mg/mL的混旋体样品，采用峰面积归一法测定制备所得紫胶桐酸对映体的相对含量，并按公式（1）计算对映体过量值（ee值）：

式中：[a]为过量的对映体相对含量/%；[b]为另一个对映体的相对含量/%。

1.3.3 紫胶桐酸手性拆分热力学研究

根据1.3.1节中柱温对紫胶桐酸对映体拆分效果的影响，结合范特霍夫（Van’t Hoff）方程与阿伦尼乌斯（Arrhenius）方程，说明所选手性色谱柱和填料类型与紫胶桐酸对映体的拆分机理和特性。

1.3.4 紫胶桐酸样品表征

1.3.4.1 差示扫描量热对比分析

差示扫描量热测试条件：取紫胶桐酸样品和标准品，以空坩埚为参比，初始温度为0 ℃，终止温度为200 ℃，升温速率10 ℃/min，恒温10 min，以保证试样吸热充分和基线平稳。加热过程均在吹扫气和保护气（均为高纯N2，其中吹扫气流速20 mL/min，保护气流速50 mL/min）的条件下进行，降温介质为液氮。

1.3.4.2 傅里叶变换红外光谱对比分析

取紫胶桐酸样品和标准品，压片基质为溴化钾，压力10 MPa，红外扫描波数范围4 000～400 cm－1，分辨率4 cm－1，累计扫描32 次。

1.4 数据统计分析

数据计算及整理采用Microsoft Excel软件进行，作图及分析采用Origin 8.0.6软件进行。

2 结果与分析

2.1 HPLC-ELSD法拆分紫胶桐酸对映体

2.1.1 流动相组成对分离效果的影响

图1 流动相组成对紫胶分离效果的影响Fig.1 Influence of mobile phase composition on separation efficiency

在色谱分析中，水、甲醇、乙腈作为常用流动相，结合紫胶桐酸在水和甲醇中的溶解性，以及乙腈的强极性，本实验采用0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-甲醇、乙腈-甲醇3 种流动相考察流动相组成对拆分效果的影响。取3 种流动相比例均为50∶50（V/V）为例，在45 min洗脱时间内，如图1所示，0.1%甲酸-乙腈溶液的洗脱峰良好；乙腈-甲醇溶液的结果显示两峰分离度太小，洗脱过快；而0.1%甲酸-甲醇溶液的组成在120 min内无法洗脱，经实际测试将比例调为0.1%甲酸-甲醇溶液为20∶80且进样量增大1 倍时，洗脱峰出现，可见0.1%甲酸-甲醇溶液的组成对紫胶桐酸样品的洗脱能力相对较弱。综上，采用0.1%甲酸-乙腈的流动相组成时，紫胶桐酸样品可在30 min内洗脱完毕，且分离度良好。

2.1.2 流动相比例对分离效果的影响

表1 流动相比例对紫胶桐酸手性拆分参数的影响Table 1 Influence of formic acid to acetonitrile ratio on resolution parameters of aleuritic acid enantiomers

图2 流动相比例对分离效果影响Fig.2 Influence of formic acid to acetonitrile ratio on separation efficiency

由表1可以看出，随着流动相中极性较强组分乙腈含量的减小，容量因子k1和k2及分离度Rs先减小后增大；分离因子α均大于1.5，则说明所有流动相组成条件下，紫胶桐酸中2 个样品峰均实现了基线分离。如图2所示，在0.1%甲酸（A）-乙腈（B）比例为40∶60及30∶70时，2 个对映体分离度、峰形都较好，且在20 min内完成洗脱，时间较短，均达到了对映体拆分的要求。尽管在流动相比例为30∶70时，样品的容量因子更小，但2 个对映体峰的分离度较40∶60时小，考虑到较宽的分离度有利于后续即将开展的制备过程，故而选择0.1%甲酸-乙腈体积比40∶60作为最佳流动相比例。

2.1.3 柱温对分离效果的影响

表2 柱温对紫胶桐酸手性拆分参数的影响Table2 Influence of column temperature on resolution parameters of aleuritic acid enantiomers

图3 柱温对分离效果影响Fig.3 Influence of column temperature on separation efficiency

如表2所示，随着柱温的升高，2 个对映体的容量因子及分离因子均呈现较为明显的下降趋势，这说明随着温度的升高，样品在固定相中的保留能力在逐渐减弱，这与Van’t Hoff方程与Arrhenius方程中，升高温度有利于加快溶质与固定相间的吸附和解吸过程的表述一致，而体现在色谱的分离参数中，即为容量因子k和分离因子α的减小。但如图3所示，在10～40 ℃的柱温范围内，紫胶桐酸2 个对映体均实现了良好的基线分离，且当温度大于25 ℃时，不仅将分离时间缩短在了20 min以内，样品峰的峰高、峰形也更好。可见，在建立分析方法时，较高的柱温有利于分离分析时取得较好的效果，而当以色谱法拆分制备样品时，适当降低柱温则可提高2 个对映体的分离度绝对值，以便于提高收集样品时的得率和纯度。综合表2及图3的结果来看，综合考虑分离效果并鉴于较低温度下仪器能耗较低、色谱柱寿命长、升温时间更短的原则，此处选择30 ℃作为最佳分离柱温。

2.1.4 线性方程的建立

将2 个对映体所得峰面积作为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制紫胶桐酸标准曲线，第1个对映体峰1的样品质量浓度与峰面积间的线性方程为y=1 183.3x－229.38，R2=0.990 2，第2个对映体峰2的样品质量浓度与峰面积间的线性方程为y=773.2x－166.1，R2=0.990 4，表明通过HPLC-ELSD法绘制的紫胶桐酸对映体标准曲线线性关系良好，即在所选色谱分离条件下，2 个对映体峰均呈现出良好的线性比例关系。

2.1.5 方法重复性结果

表3 紫胶桐酸2 个对映体线性关系的重复性考察Table3 Repeatability of the method

如表3所示，在建立的手性拆分条件下，2 个紫胶桐酸对映体峰峰面积的RSD分别为0.88%和1.9%，说明紫胶桐酸2 个对映体在所建立检测条件下均呈现出了良好的可重复性。

2.1.6 样品稳定性结果

表4 紫胶桐酸2 个对映体样品的稳定性考察Table4 Stability of the method

如表4所示，紫胶桐酸2 个对映体峰在48 h内的RSD分别为1.2%和1.5%，说明在建立的手性拆分条件下，紫胶桐酸样品可在至少48 h内得到稳定的分离和检测。

2.1.7 2 个对映体含量及ee值

表5 紫胶桐酸2 个对映体相对含量及ee值Table5 Enantiomer composition and enantiomeric excess value of aleuritic acid

由表5可知，在上述确定的最佳条件下，以0.5 mg/mL质量浓度试样对制备紫胶桐酸进行对映体含量测定时，峰1与峰2的相对含量分别为65.5%和34.5%，紫胶桐酸混旋体的ee值为31%，说明碱法制备所得紫胶桐酸光学纯度较低。可见，在对紫胶桐酸立体结构进行深度开发时，对映体样品的拆分及制备显得很有必要。

2.2 紫胶桐酸手性拆分热力学研究结果

根据2.1.3节中柱温对紫胶桐酸对映体拆分效果的影响结果，为进一步揭示紫胶桐酸手性拆分过程中，对映体与固定相间手性识别过程中的微观相互作用，依据参考文献[30-31]可用色谱参数表示如下：

式（2）、（3）中：k为容量因子；α为分离因子；R为气体常数；Ø为流动相中乙腈与0.1%甲酸溶液间的体积比值；ΔH、ΔS分别为紫胶桐酸对映体在流动相与固定相间分配过程中的焓变和熵变；ΔΔH、ΔΔS为紫胶桐酸2 个对映体在流动相与固定相间分配过程中的焓变与熵变之差。

假设紫胶桐酸对映体和固定相的作用机理在本实验所研究的温度范围内不发生改变，则lnk和lnα对分离温度的倒数1/T作图时均应呈线性关系，其斜率分别为－ΔH/R和－ΔΔH/R。依据表2结果，以lnα方程为例，其线性方程如图4所示。

图4 lnα与1/T间的线性关系方程Fig.4 lnα versus 1/T plot for enantiomeric separation of aleuritic acid

根据图4，由式（3）可求得：ΔΔH为－3 453.0 J/mol，ΔΔS为－7.677 6 J/mol，ΔΔH与ΔΔS均为负值，则说明紫胶桐酸的对映体分离过程受焓变控制，而其转折温度Tiso=ΔΔH/ΔΔS=449.7 K，说明紫胶桐酸2 个对映体手性拆分的转折温度为449.7 K，即理论上，在本实验的分离条件下，柱温高于449.7 K时，紫胶桐酸的2 个对映体不能实现分离，由此可见，本实验所选固定相对紫胶桐酸对映体在较高的温度区间均有较高的对映选择性。从分离过程来看，紫胶桐酸对映体在IF柱上的分离是因为不同的紫胶桐酸对映体与手性固定相间的微观相互作用有差异所致。从热力学角度来看，紫胶桐酸不同对映体与固定相间生成的非对映络合物具有不同的能焓，能焓越大，络合物在固定相上的保留作用越强，对映体间这种保留作用的差异使得化合物有着不同的洗脱顺序，并最终实现分离，一般认为当ΔΔH差值大于500 J/mol时，对映体间即能实现基线分离[32]，紫胶桐酸对映体间实际焓差ΔΔH为－3 453.0 J/mol，这也是紫胶桐酸对映体能够在较宽温度范围内实现基线分离的原因。ΔΔS则表示的是紫胶桐酸对映体与固定相相互作用过程中的熵变，熵变越大，说明紫胶桐酸对映体与固定相间的络合作用越强，即对固定相的有序结构利用的越充分，也就越容易实现拆分。

表6 紫胶桐酸中2 个对映体峰的lnk对1/T的线性方程Table6 lnk versus 1/T equations for enantiomer peaks of aleuritic acid

从表6中lnk与1/T的方程可求得，峰1的ΔH1为10 623.6 J/mol；ΔS1为－36.42 J/mol；峰2的ΔH2为14 076.4 J/mol，ΔS2为－44.09 J/mol。显然，2 个对映体峰的ΔH、ΔS值与出峰顺序一致，亦从侧面证明了熵变、焓变的热力学理论在解释紫胶桐酸对映体分离过程中的合理性。

2.3 紫胶桐酸样品与标准品的傅里叶变换红外光谱分析

图5 紫胶桐酸制备样品与标准品傅里叶变换红外光谱对比图Fig.5 Comparative FTIR spectra of prepared and standard samples of aleuritic acid

用于拆分的紫胶桐酸均为参照文献[16-17,19]制备，为进一步说明拆分结果的准确性，将制备样品与标准品的红外谱图对比，如图5所示。可见二者红外吸收特征峰完全一致，进一步说明制备样品确为紫胶桐酸的混旋体。现将其主要特征吸收峰归属如下：在3 306 cm－1为羟基中O－H的伸缩振动峰；在2 935 cm－1和2 848 cm－1处为CH3和－CH2－的伸缩振动特征峰；在1 725 cm－1处的峰为C＝O的伸缩振动峰；在1 467 cm－1和1 367 cm－1处的2 个峰分别为－CH2－的剪式振动和面外摇摆振动；在1 403 cm－1处的峰为羧酸－OH变形振动；在1 128 cm－1和1 087 cm－1处的2 个峰为醇的伸缩振动；在721 cm－1处的峰为－CH2－变形振动，而且亚甲基数目在4 个以上。

2.4 紫胶桐酸提取样品与标准品的差示扫描量热分析

图6 制备紫胶桐酸样品与标准品的差示扫描量热曲线对比图Fig.6 Comparison of DSC curves of prepared and standard samples of aleuritic acid

如图6所示，制备紫胶桐酸样品与紫胶桐酸标准品相比，无明显的杂质热吸收峰，二者差示扫描量热曲线表现出了较高的一致性，制备紫胶桐酸样品的熔融峰值温度为97.3 ℃，紫胶桐酸标准品为99.8 ℃；从终止温度来看，制备紫胶桐酸样品的熔融峰值温度为99.7 ℃，紫胶桐酸标准品为101.8 ℃，如图7所示，这与文献报道的强碱皂化法所得紫胶桐酸为苏式结构对映体的结果一致[22]。造成这种差异的原因可能是二者的纯度有差异且样品的结晶度不同所致。

图7 紫胶桐酸光学异构体的结构式及对映关系Fig.7 Structures and enantiomeric relationship of optical isomers of aleuritic acid

3 结 论

采用HPLC-ELSD法，考虑不同条件下的流动相组成、流动相比例、柱温等因素，确定紫胶桐酸对映体的最佳拆分的HPLC条件：色谱柱DAICEL CHIRAL PAK IF（25 cm×0.46 cm i.d.，5 μm），流速0.5 mL/min；流动相为0.1%甲酸-乙腈（40∶60，V/V）溶液，柱温为30 ℃；ELSD检测器条件：蒸发室温度70 ℃，漂移管温度60 ℃，载气（高纯氮）流速1.6 L/min。

采用强碱皂化法所得化学纯紫胶桐酸通过HPLCELSD拆分可见，其中主要有2 种光学对映体，且为苏式结构的对映异构体，其相对含量分别为65.5%和34.5%，ee值为31%。紫胶桐酸手性拆分的热力学研究结果显示：lnα与lnk与1/T均呈良好的线性关系，R2分别为0.997 2、0.995 1和0.998 0；2 个对映体焓变与熵变之差ΔΔH为－3 453.0 J/mol和ΔΔS为－7.677 6 J/mol，均为负值，说明紫胶桐酸的拆分过程受焓控制，且IF柱的改性纤维素基硅胶填料对紫胶桐酸的苏式对映体有着较强的拆分能力。傅里叶变换红外光谱及差示扫描量热曲线则进一步说明了强碱提取紫胶桐酸样品与标准品一致，均为紫胶桐酸立体异构的苏式混旋体，即苏式构型的对映异构体。