抗牛免疫球蛋白G单克隆抗体的制备及鉴定

王丽威，刘 金，武俊瑞，乌日娜，岳喜庆,

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.辽宁工程技术大学理学院，辽宁 阜新 123000）

牛免疫球蛋白（bovine immunoglobulin，Ig）在理化性质和分类命名上与其他哺乳动物及其相似，主要包括IgG、IgA、IgM和IgE四类[1]。IgG分为IgG1和IgG2两个亚类。牛IgG分子结构与人类IgG结构基本相同，由两条相同的长链多肽和两条相同的短链多肽组成的“Y”形结构，见图1。牛IgG在牛的体液中广泛分布，在初乳、血液中含量较高。在初乳的许多生物活性物质中，IgG是最重要的一种。牛初乳中IgG的含量受乳牛的年龄、泌乳期和饲喂环境等多种因素制约。研究表明，牛IgG具有抗菌、调节免疫力、保护肠道黏膜等多种生物活性[2-7]。在初乳制品的开发上，IgG含量直接决定产品的质量和价格。在初乳加工及质量检测和奶牛犊牛饲喂管理中，迫切需要建立牛IgG的免疫学检测方法。

图1 牛IgG分子结构模式图Fig.1 Schematic diagram of a bovine IgG molecule

目前牛IgG的检测方法主要为免疫分析法和亲和色谱法[2]。其中免疫分析法主要包括琼脂扩散法[8-10]、免疫比浊法[8,11-14]和酶联免疫法[9-10,15-17]等。这些快速方法都需要特异性识别牛IgG（包括IgG1和IgG2）的抗体。目前科研和生产中较为常用的抗牛IgG抗体试剂主要为兔、山羊、绵羊等动物来源的血清抗体，属多克隆抗体。这种抗体的制备方法所得抗体效价取决于不同种属动物免疫反应性，免疫方法等诸多因素，难以保证批间质量的稳定性。另外由于哺乳动物IgG之间的交叉反应严重，要获得达到实验要求的特异性往往需要繁杂的交叉吸附处理[18-19]。单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、均一性好的特点。国外学者已研制出抗牛IgG、IgG1、IgG2和IgG Fc片段的抗体[18-21]。国内高东微[22]、王平[23]、韩秀娥[24]等研究了牛IgG单克隆抗体的制备，但目前还没有商品化的抗牛IgG单克隆抗体，仅有的2 株单克隆抗体由国外进口，价格十分昂贵。因此，利用杂交瘤技术制备分泌抗牛IgG的单克隆抗体，对于牛IgG的免疫学检测技术的建立，具有重要的实际应用价值和理论研究意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雌性BALB/c小鼠，吉林大学实验动物中心提供，动物生产合格证号为SCXK（吉）2011-0001；SP2/0小鼠骨髓瘤细胞由吉林大学人兽共患病研究所提供。

标准牛IgG、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体、山羊抗牛IgG抗体、牛乳酪蛋白、牛乳β-乳球蛋白、牛乳铁蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、冷水鱼明胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、单克隆抗体亚类鉴定试剂盒 美国Sigma公司；山羊IgG、绵羊IgG、兔IgG、牛IgM 北京博奥森公司；牛IgG1、牛IgG2、牛IgG Fab片段、Fc片段 美国Fitzgerald公司；RPMI-1640培养基 美国Gbico公司；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB） 济南泰天和公司；蛋白G亲和层析柱 美国GE公司；胎牛血清美国Hyclone公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪 美国BioTek公司；二氧化碳培养箱香港利新公司；高速冷冻离心机 美国Thermo公司；AKTA蛋白纯化系统 美国GE公司；垂直电泳仪美国Bio-Rad公司；凝胶成像分析系统 美国UVP公司；超低温冰箱、倒置显微镜 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 动物免疫

取6 周龄雌性BALB/c小鼠，用乳化抗原（标准牛IgG加入等量完全弗氏佐剂乳化）腹腔注射，100 μg/只。2周后用乳化抗原（标准牛IgG加入等量不完全弗氏佐剂乳化）腹腔注射，100 μg/只。2 周进行第3次免疫，操作同第2次免疫。1 周后采用间接酶联免疫吸附（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）法测定血清效价，选择血清效价最高的小鼠在融合前3 d注射牛IgG加强免疫。

1.3.2 细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选

参考文献[25]进行细胞融合。加强免疫3 d后，取小鼠脾脏，制备细胞悬液，与SP2/0骨髓瘤细胞按10∶1的比例混合，缓慢加入1 mL预热的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），37 ℃水浴中融合30 s，立即1 000 r/min离心2 min。缓慢加入RPMI-1640培养基20 mL，800 r/min离心4 min，弃上清液，如此再洗1 次；融合物移至装有50 mL含20%胎牛血清的HAT培养基中，混匀，加入到已准备好饲养层的96 孔细胞培养板中，每孔100 mL，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

融合细胞培养至8～14 d，细胞集落长到孔底面积的1/4～1/2大小，培养液变黄，取细胞上清液，用改进的夹心ELISA方法进行抗体检测，其具体步骤为：在酶标板的每个孔中加100 μL稀释1 000 倍的羊抗牛IgG抗体，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，加含有0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline containing 0.05%Tween 20，PBST）洗涤3 次；加0.1 mol/L氯化铵溶液封闭，37℃温育1 h，洗涤3 次；加杂交瘤细胞株培养液上清液100 μL于反应孔中，置37 ℃温育1 h，洗涤3 次。同时以阴性培养液上清液作阴性对照，以阳性血清作阳性对照，以PBS作空白对照。各反应孔中加入5 000 倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体100 mL，37 ℃温育40 min，洗涤5 次；加入刚刚配制的TMB底物溶液100 μL，37 ℃暗处温育10 min。加入终止液50 μL，立即在酶标仪上测定OD450nm。

采用有限稀释法对筛选出的阳性孔进行克隆。多次克隆直至所有细胞堆检测均为阳性，停止克隆。将阳性细胞株转移至6孔板中进行扩大培养。选取对数生长期杂交瘤细胞，按程序冷冻保存。

1.3.3 单克隆抗体的制备

采用小鼠腹腔诱导腹水制备单克隆抗体。取16 周龄雌性BALB/c小鼠数只，每只腹腔注射0.5 mL石蜡油，7～10 d后腹腔注入扩大培养的杂交瘤细胞（5×105个/只）。2 周后，采集腹水，37 ℃放置1 h，4 ℃过夜，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，收集腹水上清液，－80 ℃冻存。

1.3.4 单克隆抗体的鉴定

1.3.4.1 单克隆抗体效价的测定

采用间接ELISA方法测定腹水抗体效价。具体步骤为：牛IgG质量浓度为1 μg/mL，4 ℃包被过夜，0.1 mol/L氯化铵溶液37 ℃封闭1 h，将腹水从10 000 倍开始倍比稀释后加入酶标板孔中，37 ℃温育45 min，PBST洗涤3 次，加入5 000 倍稀释的羊抗鼠酶标二抗，100 μL/孔，37 ℃温育1 h，PBST洗涤3 次，加入TMB底物溶液，100 μL/孔、37 ℃避光反应10 min，每孔加入50 μL终止液，酶标仪测定OD450nm值。同时以等稀释度阴性腹水作为对照。计算平行稀释的单克隆抗体OD值与阴性对照OD值的比值（P/N），P/N大于2.1时的最大稀释倍数为单克隆抗体的效价。

1.3.4.2 单克隆抗体亚类的鉴定

用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚类（按说明书操作）。

1.3.4.3 单克隆抗体的纯化

采用G蛋白亲和层析法纯化腹水单克隆抗体。取出冻存腹水，于4 ℃中缓慢解冻，12 000 r/min离心20 min，取上清液用0.22 μm膜过滤器过滤。收集的滤液经HiTrap Protein G HP的柱子进行纯化；首先用10倍柱体积的20 mmol/L pH 7.0磷酸缓冲液洗柱，然后用注射器以1 mL/min的进样速度加入5～10 倍柱体积的溶于上样缓冲液的腹水抗体，用上样缓冲溶液冲洗柱子至OD280nm小于0.008，最后用2～5 倍柱体积的0.1 mol/L pH 2.7甘氨酸盐酸缓冲液洗脱，用1.5 mL EP管（每管已加入100 μL 1 mol/L pH 9.0 Tris-HCl缓冲液）收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH值，如果pH值低于7可利用中和缓冲液调至约pH 7.4以防止抗体的变性。单克隆抗体纯化后，用截留量分子质量为8 000 Da的透析袋，4 ℃透析48 h，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测抗体纯度。

1.3.4.4 单克隆抗体反应性分析

酶标板包被牛IgG、牛IgG1、牛IgG2，间接ELISA检测4株单克隆抗体与牛IgG1、IgG2的反应性。

1.3.4.5 单克隆抗体识别抗原表位区域的确定

采用ELISA法检测单克隆抗体对牛IgG分子识别部位。酶标板上分别按1 μg/mL包被牛IgG全分子、牛IgG酶解Fc片段和Fab片段，其他同间接ELISA法。

采用免疫印迹法（Western Blot）检测单克隆抗体识别牛IgG重链、轻链。取约0.05 μg牛IgG进行12%（质量分数）SDS-PAGE，结束后用150 mA恒流转膜1.5 h至硝酸纤维膜，用5%脱脂奶粉室温封闭3 h，用质量浓度为1 mg/mL的单克隆抗体在4℃反应过夜，同时以未免疫小鼠血清IgG和羊抗牛IgG多克隆抗体作阴性、阳性对照。PBST洗3 次后再用PBS洗2 次，加酶标二抗反应45 min，PBST洗3 次，PBS洗2 次后加底物，观察显色情况，考察单克隆抗体的抗原识别区域。

1.3.4.6 单克隆抗体特异性分析

选择几种常见动物IgG、牛奶来源蛋白质及反应体系中涉及到的蛋白测定交叉反应率。以不同质量浓度的牛IgG和其他蛋白分别作竞争抑制曲线，计算各自的结合率，求出各自在50%抑制浓度（IC50）时的质量浓度，用公式（1）计算交叉反应率，考察单克隆抗体的特异性。

式中：S为交叉反应率/%；y为IC50时牛IgG的质量浓度/（μg/mL）；z为IC50时其他蛋白的质量浓度/（μg/mL）。

1.3.4.7 单克隆抗体亲合力的测定

利用非竞争性酶免疫法测定9C6抗体亲合力。牛IgG按1、0.5、0.25、0.125 μg/mL包被酶标板。蛋白质量浓度为1 mg/mL单克隆抗体从500 倍开始倍比稀释后按间接ELISA方法进行测定。以单克隆抗体浓度（mol/L）的对数为横坐标、OD450nm为纵坐标，绘制4条S形曲线。以S形曲线的顶部为最大光密度ODmax，求出各曲线50%ODmax对应的单克隆抗体浓度（IC50，mol/L）。将4 个浓度两两分组，根据公式（2）计算亲合力常数。

式中：Ka为亲合力常数；n为每组中两个包被抗原浓度的倍数；[Ab’]t和[Ab]t分别为每组中两条曲线IC50对应的抗体浓度/（mol/L）。

2 结果与分析

2.1 免疫小鼠血清效价测定结果

小鼠3 次免疫后用间接ELISA法检测血清效价，由表1可以看出，P/N大于2.1的最大稀释倍数为2.048×106倍，因此4 只小鼠的血清效价均达到融合要求。

表1 免疫小鼠血清效价测定结果Table1 Serum titers of immunized mice

2.2 杂交瘤细胞株的筛选结果

免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合后，计数融合株，计算得出融合率在30.5%～42.3%之间。对融合株细胞上清液进行检测，并对阳性株进行克隆筛选，最终从90 株融合株里筛选得到4 株稳定分泌抗牛IgG单克隆抗体的细胞株，分别命名为2F6、5E3、9C6、9H8。

2.3 单克隆抗体鉴定结果

2.3.1 单克隆抗体效价测定结果

图2 单克隆抗体效价测定结果Fig.2 Titers of McAbs

由图2可以看出，2F6和5E3抗体效价为2.56×106，9C6和9H8为5.12×106。

2.3.2 单克隆抗体亚类鉴定结果

表2 单克隆抗体亚类鉴定结果Table2 Identification of subtypes of McAbs

如表2所示，2F6、5E3、9C6、9H8四株杂交瘤细胞分泌的抗体均为IgG1型。2F6、9H8的轻链为k型，5E3、9C6轻链为λ型。

2.3.3 单克隆抗体纯化结果

采用G蛋白亲和层析方法对腹水抗体进行纯化，纯化后抗体经SDS-PAGE进行纯度鉴定，由图3可以看出，纯化后的抗体在50 kDa和25 kDa位置出现清晰条带，分别对应抗体的重链和轻链，表明抗体纯化取得了较好的效果。

2.3.4 单克隆抗体反应性测定结果

采用间接ELISA法测定4 株单克隆抗体与牛IgG1和IgG2的反应性，由表3可以看出，2F6、9H8只与牛IgG1反应，5E3只与牛IgG2反应，9C6与牛IgG1和IgG2均发生反应。

图3 单克隆抗体纯化前后SDS-PAGE图Fig.3 SDS-PAGE of ascites and purified McAbs

表3 单克隆抗体对IgG1和IgG2反应性Table3 Reactivity of McAbs with IgG1 and IgG2

2.3.5 单克隆抗体识别抗原表位区域的确定

分别以牛IgG全分子、IgG酶解Fab片段和Fc片段为抗原包被酶标板，采用间接法测定单克隆抗体对牛IgG分子的识别区域，表4结果表明，2F6、9C6识别Fab片段，而5E3、9H8识别Fc片段。进一步采用Western Blot检测其对牛IgG片段的识别。

表4 单克隆抗体对牛IgG片段的识别（ELISA）Table4 Recognition of bovine IgG fragments by McAbs (ELISA)

牛IgG在SDS-PAGE过程中，在SDS作用下二硫键被破坏，分解为重链和轻链，分子质量分别为50 kDa和25 kDa。电泳后转膜后，加单克隆抗体反应，经酶标二抗检测，由图4可以看出，2F6单克隆抗体与25 kDa位置的条带反应，即与牛IgG轻链发生反应，而5E3、9H8和9C6与50 kDa位置的条带反应，即与牛IgG重链反应。结合表4结果判断，9C6单克隆抗体识别牛IgG Fab段重链部分，而2F6识别牛IgG Fab段轻链部分，5E3、9H8识别牛IgG重链Fc段部分。因此，确定9C6为牛IgG免疫分析研究用抗体，对其进行进一步鉴定。

图4 免疫印迹结果Fig.4 Western Blot

2.3.6 单克隆抗体交叉反应性的测定结果

表5 9C6交叉反应率Table5 Cross-reactivity of 9C6%

9C6与几种动物IgG和免疫检测常用蛋白的交叉反应性测定结果见表5。9C6产生的单克隆抗体与山羊IgG（G IgG）、绵羊IgG（S IgG）、兔IgG（R IgG）、牛IgM（B IgM）、牛乳酪蛋白（CN）、牛乳β-乳球蛋白（β-Lg）、牛乳铁蛋白（LF）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清白蛋白（OVA）、鱼明胶（FG）的交叉反应率均小于1%。

2.3.7 单克隆抗体亲合力的测定结果

图5 9C6亲合力测定结果Fig.5 Affinity of 9C6

如图5所示，经计算，9 C 6的亲合力常数为8.92×108L/mol，属于较高亲合力的抗体。

3 讨 论

按常规方法从动物血清中提取特异性的抗牛IgG的抗体需要繁琐的吸收程序，研究制备的抗牛IgG单克隆抗体效价高、特异性强、性质稳定、可重复性好。利用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体技术自1975年建立以来，许多研究者利用该技术获得了诸多克隆抗体原的单克隆抗体，但是抗牛IgG的单克隆抗体少之又少，原因主要在于用来培养杂交瘤细胞的培养基中含有牛血清，而牛血清中含有牛IgG，使得杂交瘤细胞产生的抗体一经分泌便与培养基中的IgG结合，造成了阳性克隆筛选的困难，使得许多研究者没能成功地获得有效的抗体。早在1982年，国外就报道了抗牛IgG单克隆抗体的制备[18]，实验中为排除牛血清中IgG的干扰，采用无血清培养基。这种培养基中细胞形态容易发生变化，甚至死亡，即使存活的细胞也容易失去原有的功能和生物学特性。而且，无血清培养基成本远高于血清培养基。本研究中创造性地采用了改进的夹心ELISA模式检测杂交瘤细胞上清液中已经形成的抗原抗体复合物，从大量的杂交瘤细胞株中筛选得到4株阳性细胞株。抗体的亲合力常数是对抗体与抗原之间作用的最本质的描述，是表示抗原表面单一决定簇与相应抗体单一结合位点的结合强度。在单克隆抗体的特性鉴定中，亲合力常数的测定十分重要。一般认为，亲合力常数在107～1012L/mol之间时，属于高亲合力的抗体，在105～107L/mol之间时，属于低亲合力的抗体[26]。本研究利用非竞争性酶免疫法测定抗体亲合力，测得9C6的亲合力常数为8.92×108L/mol，证明其分泌的抗体为高亲合力抗体，可以满足免疫学检测方法的要求。

高东微等[22]用木瓜蛋白酶解IgG制备Fc片段用作免疫原免疫小鼠，通过细胞融合和筛选获得一株分泌Fc片段的单克隆抗体，腹水单克隆抗体效价较高，与酪蛋白、乳清蛋白等交叉反应率均小于1%，但未鉴定与抗原结合的片段。王平等[23]筛选得到4 株分泌抗牛IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，相加实验结果证明其中的1 株与其他3 株产生的抗体针对不同的抗原表位，但没有明确鉴定出具体的识别片段。而且，这株单克隆抗体既与牛IgG反应也与羊IgG反应。韩秀娥等[24]报道用IgG全分子免疫小鼠制备抗牛IgG单克隆抗体。以上3 个报道未提及单克隆抗体与牛IgG1和IgG2的反应性。本研究制备的抗体效价高、特异性好，与牛IgG1和IgG2均能发生反应，这一点为准确测定样品的IgG含量提供了有效保障。牛IgG1和IgG2的Fab片段相同，Fc片段既有差异序列，也有一些共同的抗原决定簇[1,27]。据测定，牛血清中IgG1质量浓度6.0～15.1 mg/mL，IgG2质量浓度5.0～13.5 mg/mL[27]。牛初乳中IgG1质量浓度30.0～75.0 mg/mL，IgG2质量浓度1.9～4.0 mg/mL[27]。因此无论是血清样品还是初乳样品中牛IgG的量都应为二者的总和。若抗体不能保证针对IgG1和IgG2两种抗原，则无法保证检测的可靠性。此外，由于哺乳动物IgG的同源性，制备出的抗牛IgG的单克隆抗体易与其他种类的动物IgG发生交叉反应，如山羊、兔等[19,28-30]。国际上Sigma公司和Abcam公司出售的商品抗牛IgG单克隆抗体均来自BG-18细胞株，从侧面反映出获得产生特异性强、效价高的抗牛IgG单克隆抗体细胞株的困难程度。因此，可以认为，本研究制备的单克隆抗体具备牛IgG免疫学分析所用抗体的特性，是一株优良的抗体。经过进一步研究可以有以下几个方面的应用：1）经HRP、FITC等标记后用于免疫组化、免疫印迹、免疫层析、免疫传感器等检测体系中检测牛IgG，包括牛初乳及制品中IgG浓度的检测、小牛被动免疫情况、疫苗等细胞培养生物制品中残留牛IgG含量测定以及作为二抗检测各种疾病的病原；2）单克隆抗体与sepharose CL-4B介质偶联制成亲和层析填料，可用于高纯度牛IgG、牛IgG及其酶解片段的制备和超低IgG胎牛血清的制备。

4 结 论

将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经筛选得到稳定分泌抗牛IgG单克隆抗体的细胞株4 株：5E3、2F6、9C6和9H8，其抗体亚型均为IgG1，腹水抗体效价可达到5.12×106。腹水抗体经G蛋白亲和层析纯化后，纯度较高；采用ELISA和Western Blot法对抗体识别抗原片段进行鉴定，结果表明，5E3、9H8识别牛IgG重链Fc片段，2F6识别牛IgG轻链Fab片段，9C6识别牛IgG重链Fab片段；只有9C6与牛IgG1和IgG2均反应；进一步的交叉反应性测定结果表明，9C6与山羊IgG、绵羊IgG、兔IgG、牛IgM、牛乳酪蛋白、牛乳β-乳球蛋白、牛乳铁蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、鱼明胶的交叉反应率均小于1%；9C6的亲合力常数达8.92×108L/mol，属于高亲合力抗体，可用其进行免疫学方法的建立和应用研究。