基因编辑技术在细胞治疗中的研究进展

朱碧云 李林夕 王立人 李大力

越来越多的研究发现，绝大多数疾病的易感性都与DNA的变异相关，其中最为典型的例子就是通常所说的遗传疾病，特别是单基因遗传病。在已知的6000多种遗传病中，目前只有大约5%的疾病可以通过定期服用小分子药物或酶替代疗法进行治疗，超过 95%的病种没有有效的治疗方案，治愈更是无从谈起。上世纪60年代提出了基因治疗概念，希望通过导入治疗性基因药物来治愈由于基因缺陷而造成的疾病，为遗传疾病的治疗带来了希望，特别是单基因突变造成的遗传病 [https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/]。经典的基因治疗主要有两种策略：在体（in vivo）基因治疗和离体（ex vivo）细胞介导的基因治疗。前者是直接利用递送载体（主要分为重组病毒载体和非病毒递送载体）将基因药物进行局部注射或者静脉注射导入到靶器官进行表达而弥补缺陷基因的功能；后者主要是将患者的细胞（一般是成体干/祖细胞、以CAR-T细胞疗法为代表的免疫细胞或者极具应用前景的 iPS细胞）分离培养，同时进行基因操作以修复患者细胞的遗传缺陷，再通过自体回输来进行治疗。

通过数十年的努力，基因治疗在最近几年获得了突破性的进展。截止到 2018年，全球已经开展了2600多项基因治疗的临床研究，共有7个基因治疗药物分别在中国、美国和荷兰等国家获批：4个用于肿瘤治疗（2个溶瘤病毒：英文名为Oncorine和T-VEC；2个CAR-T细胞疗法：Kymriah和 Yescarta）、3个用于遗传疾病治疗（治疗脂蛋白脂肪酶突变的Glybera，治疗腺苷脱氨酶突变造成重症联合免疫缺陷的Strimvelis以及治疗REP65基因突变造成先天性黑矇症的Luxtuma）。Strimvelis、Kymriah和 Yescarta这 3个药物都是通过离体细胞治疗的方式分别将基因药物整合到患者造血干细胞和T细胞再自体回输，可见细胞介导的基因治疗策略非常成功。细胞治疗相对于体内治疗显著的优势在于可离体编辑靶细胞群，用可编程核酸酶修饰后可将校正后的细胞移植回原始宿主中。这种治疗模式可以利用多种基因药物的递送体系来对靶细胞进行基因操作，例如电穿孔、阳离子脂质、细胞穿透肽和病毒载体。这些导入方式与直接导入体内的在体疗法相比具有更高的效率，同时体外基因操作的干细胞具有可培养和传代扩增优势，能进一步地富集所需的阳性细胞，有效提高治疗效率。许多离体治疗可以控制所递送的治疗分子的特定剂量，从而减少核酸酶的脱靶修饰。离体细胞的纯化、培养和移植等专业技术的长足发展也为细胞治疗提供强有力的技术支持。目前来说，获批的几个基因治疗产品无一例外都是通过重组病毒作为递送载体，不可避免地出现两个方面的担忧：一是非整合型病毒表达基因药物时效性不够长而整合型病毒会将外源基因随机插入到受体细胞的基因组中，另一个是可能导致肿瘤的发生。最理想的策略是将基因药物精确整合到基因组的特定位点，实现长时间稳定表达。由于肿瘤基因治疗的特殊性以及本期有专文讨论CAR-T细胞疗法的进展，本文主要围绕基因编辑介导的离体细胞治疗的研究进展进行回顾和展望。

1 基因编辑进展概述

近年来，随着多种人工核酸内切酶技术的出现，高效的基因编辑技术得到了快速发展和广泛应用。人工核酸内切酶技术主要包括4种：大范围核酸酶技术（meganuclease）、锌指核酸酶技术（zinc finger nuclease，ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶技术（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 （ CRISPR-associated proteins，Cas）系统。通过人工核酸酶可以精确靶向双链 DNA产生双链断裂（double strand break，DSB）。DSB促使细胞启动两种主要的DNA损伤修复机制：非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重组（homology-directed repair，HDR）。NHEJ可以发生在细胞周期的任一时期，是最主要的高效修复方式，但是由于通过NHEJ精确修复（canonical non-homologousend joining，C-NHEJ）的 DNA 序列会再次被核酸酶切割，所以最终会出现不同长度片段（主要是少数几个碱基）的插入、删除或替换（insertion/deletion/substitution，indel），从而导致基因失活（alternativenon homologous end joining，A-NHEJ）。HDR是一种精确但低效的修复方式，在有同源序列作为重组模板的前提下仅发生于细胞周期的 S/G2期。基于CRISPR/Cas9技术，将胞嘧啶脱氨酶或者腺苷脱氨酶与 Cas9缺口酶（Cas9-nickase，Cas9n）融合，产生了单碱基编辑（base editing）技术。单碱基编辑技术直接利用脱氨酶将碱基脱氨通过DNA复制精确引入碱基替换，最大的优势是效率高，不依赖于同源重组也极少引起indel，有着更安全的特点，具有非常大的应用潜力。与此同时，随着科学家对基因编辑工具认识的不断加深和改造，基因编辑工具的应用领域也从基因组编辑发展到了表观基因组编辑和转录组调控领域，开发出一系列表观基因组编辑工具和转录调控相关工具。这些工具展示了基因编辑技术的超强可塑性，增加了更多的应用场景，也在基因治疗中展现了无可比拟的优势。

2 细胞治疗中多种基因编辑策略的应用

经典的基因治疗只能将外源基因添加到细胞中，通过过表达基因产物达到治疗的效果。基因编辑技术则更加灵活，可以通过定点整合来修复突变基因或者过表达治疗性基因产物，可以删除基因编码区部分序列达到基因失活的效果，还能作用于基因的启动子序列来增强或者减弱基因表达。体内基因编辑治疗的基础研究进展较快，例如通过同源重组在肝脏中原位修复致病突变，治愈I型酪氨酸血症（hereditary tyrosinaemia type I，HT-I）、B 型血友病和致命性高血氨症；通过在耳蜗毛细胞中敲除TMC1致病性的杂合突变等位基因而保留正常的等位基因，恢复模型小鼠听力；通过基因编辑删除dystrophin基因中提前出现终止密码子的外显子区段，在小鼠和狗中显著改善杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）的症状。

然而，在体基因治疗也只能针对部分疾病，对于体内病毒感染效率非常低的造血干细胞等束手无策，而且包括我们课题组在内的研究均发现即便是体内AAV感染效率最高的肝细胞，在成年动物中通过同源重组修复单个碱基突变的效率都低于5%，通常只有2%以下。而离体细胞治疗的方法可以高效感染造血干细胞，例如2018年4月，《The New England Journal of Medicine》杂志上发表了一项关于 β-地中海贫血症（β-thalassemia，简称β地贫）治疗的重要成果。研究者从患者体内提取出 CD34+造血干细胞，通过转染LentiGlobin BB305慢病毒载体导入可编码成人血红蛋白 β-链的HbAT87Q基因，再重新回输到患者体内，实现患者红细胞中正常β珠蛋白的高表达，这项基于自体细胞的基因疗法，最终减轻了患者的贫血症状和输血依赖。值得注意的是，其减少输血依赖的有效率达100%，并且在之后的随访中，经治疗的22例患者的长期输血需求明显减少，或已完全不需要输血，该疗法并没有带来明显的副作用。

离体细胞治疗还可以在体外扩增或富集有效导入的阳性干细胞，提高治疗成功率。例如，2017年，Michele De Luca课题组报道了通过自体移植转基因表皮干细胞，在一个患有严重交界型大疱性表皮松解症（Junctional Epidermolysis Bullosa，JEB）的7岁儿童身上修复了80%左右的表皮。通过从病人中分离表皮干/祖细胞，将正常的LAMB3基因通过逆转录病毒导入患者细胞，形成稳定感染的克隆后在体外扩增形成类似于表皮的结构再进行自体移植。这些细胞形成上皮组织可永久性地恢复大量皮肤的缺陷。这些通过逆转录病毒或慢病毒直接导入外源基因的传统基因疗法在临床上取得了巨大的成功，说明基于细胞的基因治疗在很多疾病治疗方面有着巨大优势，但是传统方法采用的慢病毒导入方式有着随机整合的致瘤风险，因此需要新的策略实现高效精确整合。下面将围绕不同的基因编辑策略探讨其在细胞治疗中的应用及进展。

2.1 利用NHEJ的基因编辑治疗思路

通常情况下，由于NHEJ修复往往造成单个或多个碱基的插入或缺失，常常用于破坏正常的基因阅读框，使基因失活。利用这一策略最为成功的例子是人们可通过ZFN在T细胞中敲除HIV共受体之一的CCR5基因进行艾滋病的治疗。在欧洲有部分人CCR5基因编码区第185位氨基酸密码子以后发生了32个碱基缺失导致基因失活，这些人对HIV-1病毒有天然的免疫力。2007年，Brown在德国一家医院接受天然CCR5突变的造血干细胞移植进行白血病治疗，同时他体内的HIV病毒也完全消失了，成为世界上首例被“治愈”的艾滋病患者。受此鼓舞，研究者在前期研究中分别在人CD4+T细胞和造血干/祖细胞利用ZFN破坏CCR5基因，编辑效率分别为 50%和 17%。将编辑后的细胞移植到免疫缺陷小鼠中，用HIV-1病毒攻击可以进一步富集CCR5基因缺失的细胞，证明了该疗法的可行性。在此基础上，研究者将12名HIV-1感染者的T细胞分离出来，利用ZFN对CCR5的编码区进行编辑，细胞体外扩增后，每位患者一次性注入 100亿个T细胞（CCR5编辑效率为11%～28%）。随机分组的6名患者在自体T细胞移植4周后开始停止服用抗逆转录病毒药物，其中4名患者12周检测时病毒数量显著减少。该研究是第一个利用基因编辑进行疾病治疗的临床研究，从概念上证明基因编辑用于基因治疗的安全性和有效性，具有划时代的意义。然而也可以看到 ZFN的基因编辑效率比较低，这主要是ZFN本身编辑活性有限，另外T细胞和造血干细胞的基因递送难度较大。该研究中所用的质粒DNA电转和腺病毒递送都不能达到很高的效率。最近 Alexander Marson实验室利用CRISPR/Cas9在CD4+T细胞中使 CCR5的表达量下降了近80%，并有效阻止了HIV-1病毒衣壳的感染。

NHEJ除了可以用来破坏基因的编码框，也可以作用于启动子、增强子等非编码序列，抑制或者激活目的基因的表达，达到治疗的效果。β地贫是临床上常见的遗传性血液病之一，其病因是β珠蛋白基因的突变，导致本应与其结合形成成人血红蛋白（adult hemoglobin，HBA）的 α珠蛋白在红细胞前体中不断积累使红细胞前体过早凋亡。若能重新开启人体中被沉默的γ珠蛋白（主要在胎儿期表达，出生后表达被沉默）表达则能够使游离的α珠蛋白与γ珠蛋白形成胎儿血红蛋白（fetal hemoglobin，HBF），达到治疗 β地贫的目的。BCL11A正是负责沉默 γ珠蛋白的主要转录抑制因子，由于BCL11A基因在造血干细胞中有着关键作用，不能直接敲除。2015年哈佛医学院Dan E. Bauer研究小组与麻省理工学院的张峰研究组合作，利用 CRISPR/Cas9技术在红细胞前体细胞系HUDEP2中筛选得到了一个BCL11A的红系特异性增强子。和预期的一样，在利用CRISPR/Cas9技术破坏该增强子后，BCL11A在红细胞前体中的表达大大降低，而γ珠蛋白的表达以及HBF的含量则大大提高，造血干细胞的正常红系和多能分化功能并未受到影响。由于造血干细胞的分离和移植技术已经很成熟，在分离后的造血干细胞中敲除BCL11A增强子，随后重新移植入患者体内就有可能治愈或缓解患者的病情。而就在一年后来自St Jude儿童医院的Mitchell J Weiss研究组再次将治疗β珠蛋白类突变疾病的理想向前推进了一步，与Dan E. Bauer研究组不同的是，他们将 CRISPR/Cas9的靶点直接指向了γ珠蛋白的启动子-102～-104区域。有研究表明，该区域为BCL11A的结合位点，临床上发现如果该区域发生缺失同样能够导致 γ珠蛋白升高[即高胎儿血红蛋白症（heterocellular hereditary persistence offetal hemoglobin，HPHF）]。Weiss研究组在镰刀状贫血（sickle cell disease，SCD，该疾病同样是β珠蛋白突变导致的）病人的造血干祖细胞中针对-102～-104区域利用 Cas9进行编辑后发现，低氧诱导产生的病态镰刀状细胞比例由20%以上降低到了个位数比例。以上两项研究对β地贫和镰刀状贫血的治疗有着巨大的意义，相关的临床研究（Clinical-Trials.gov Identifier：NCT03655678）也已经被开展。

利用基因编辑工具在相近的基因组区域产生两个DSB。NHEJ修复过程中还可能将两个DSB区间的DNA序列倒位后再连接起来，可以针对由于倒位而产生的遗传疾病。来自法国染色质和基因发育调控实验室Annarita Miccio研究组的研究表明，在造血干/祖细胞中，利用CRISPR/Cas9敲除δ与β珠蛋白基因间 13.6 Kb或使其倒位也可以重新激活胎儿血红蛋白的表达。类似地，来自韩国的Jin-Soo Kim的研究小组在两篇报道中分别利用 TALEN和CRISPR/Cas9技术在 iPS细胞中成功修复了140 KbDNA和600 Kb倒位的A型血友病细胞模型，这些修复后的 iPS细胞在分化成内皮细胞并进行皮下移植后成功缓解了 A型血友病模型小鼠的疾病症状。

总的来说，虽然ZFN、TALEN和 CRISPR/Cas9理论上都适用于基于 NHEJ的细胞治疗，但是CRISPR/Cas9系统仅需根据不同位点设计相应的 sgRNA，更加简单灵活而高效，所以在 CRISPR/Cas9技术出现以后越来越多的相关领域的研究开始转向利用 CRISPR/Cas9系统。特别是对于需要产生多个 DSB的治疗模型，利用 CRISPR/Cas9技术只需递送多个577sgRNA，非常简便。而反观利用 ZFN或者 TALEN的方法都需要多递送1对或多对核酸分子，增加了递送成本和难度，也大大降低了同时编辑的效率。

2.2 利用 HDR的基因编辑治疗思路

在大多数由基因突变导致的疾病当中，仍然需要通过精准的基因修复或者在安全位点（例如，AAVS1基因座）插入正常的基因才能够实现基因治疗，此时利用DSB来提高HDR就变得意义重大。来自Sangamo公司的 Wang等通过电转将ZFN-mRNA递送到HSPC后再利用 AAV6病毒递送供体模板，成功地将GFP基因分别插入到了CCR5和AAVS1位点中，效率分别达到了17%和26%，而在胎肝来源的HSPC中效率更是高达19%和43%。而此前仅利用IDLV（integration deficient lenti virus）作为供体的定点整合效率只有0.1%。利用类似的手段，来自Sangamo公司的Kang研究组等在慢性肉芽肿病人来源的HSPC中，将治疗性的gp91phox基因成功地特异性整合到AAVS1基因座，效率约为7.1%。NSG小鼠移植模型证明了长期再生性造血干细胞和祖细胞（long term repopulating HSPC）的确得到了正确的基因插入，为治疗人类血液和免疫系统疾病提供了新的思路。DeWitt等则通过优化包含Cas9蛋白和 sgRNA的核糖核蛋白（RNP）复合物来递送CRISPRCas9系统，利用单链 DNA寡核苷酸（ssODN）作为供体修复SCD突变，精确修复的效率高达 33%，经校正的 HSPC产生了较少的镰状血红蛋白RNA和蛋白质，并且当分化成红细胞时相应地增加了正常的血红蛋白表达。将经过编辑的人HSPC移植到NSG小鼠体内，HSPC中的基因编辑效果可以维持整整16周，具有非常好的临床应用前景。基因整合效率与治疗效果直接相关，如何进一步提高修复后细胞的比率一直是困扰研究者的问题。利用AAV6病毒作为供体，Porteus实验室通过电转Cas9与sgRNA的RNP复合物来切割基因组，成功将带有正常HBBcDNA以及tNGFR筛选标签的供体片段插入了SCD患者造血干细胞的HBB启动子之后，效率达到了11%。尽管核酸酶产生的DSB已经将重组效率提高了3个数量级，然而在Porteus的实验中仍远远达不到直接用于治疗的级别。为了富集基因定点整合的造血干细胞，Porteus研究组在插入目的基因的同时插入了tNGFR胞外段标签，使得它们可以通过微磁珠来富集发生正确重组的细胞，经过富集后HBB的整合效率在tNGFRhigh细胞中约为86%。

为了提高重组效率，研究人员也在不断寻找促进HDR的小分子药物如SCR7、RS-1等，抑或尝试新的供体设计如单链寡核苷酸（SSODN）、HMEJ供体、硫代磷酸酯修饰供体等，不过还需要更多的实验数据来验证这些药物在临床运用上的价值。

2.3 利用单碱基编辑工具的治疗思路

虽然 HDR的灵活性和准确性高，但是修复效率一直是其限制因素，使其在基因治疗中的应用充满了局限性。迄今为止在已知的疾病数据库中，突变类型最多的还是单碱基突变[或称单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）]。2016年，来自哈佛大学的Liu研究团队、中国科学院的常兴课题组以及日本神户大学的 Akihiko Kondo团队先后分别利用胞苷脱氨酶 rAPOBEC1、hAID和 PmCDA1（来自七鳃鳗的AID）开发出了能够将C/G碱基对突变为T/A碱基对的胞苷碱基编辑工具（cytidinebase editors，CBE）。一年后，Liu课题组又利用“噬菌体协助的持续进化（phage-assisted continuous evolution，PACE）”创造出了将A/T碱基对突变为 G/C碱基对的腺苷碱基编辑工具（adenine base editors，ABE）。总体来说，两类碱基编辑工具的工作原理是将不同的DNA脱氨酶（rAPOBEC1、AID 或 tadA）融合在 Cas9的 N-端表达，利用Cas9/sgRNA将脱氨酶靶向目标序列，进而利用各自融合的脱氨酶实现碱基的脱氨和转变。

碱基编辑工具的优势在于编辑过程中不易发生大片段缺失、平均效率较HDR高，为疾病的精确治疗提供了新的思路。其最直接的应用是原位修复导致疾病的突变。2017年，Liang等首次在人类的胚胎中实现了β珠蛋白基因（HBB）第28位A＞G的突变修复（HBB28 A＞G是导致地中海贫血的常见突变之一），在概念上实现了利用碱基编辑工具治疗遗传疾病的目的。除此之外利用碱基编辑工具可以更精确高效地通过对剪切供体和受体的突变调控mRNA的剪切。这一点有望用于一些特殊的遗传疾病，例如DMD。2018年，常兴课题组利用的AID-saCas9通过外显子跳跃技术恢复了DMD病人iPS细胞中DMD的转录本，从而恢复了DMD蛋白的功能。

然而，碱基编辑工具的发展目前还处于起步阶段，仍然面临着一些挑战。例如，spyCas9蛋白过大导致单碱基编辑工具的大小普遍在4.5 Kb以上，增加了 AAV病毒的包装难度，甚至使其无法包装；该工作位点受到NGG PAM的限制；编辑窗口较宽，容易造成“旁观者突变（Bystander mutation）”。为此研究人员包括本课题组开发出了基于Cpf1、saCas9等较小CRISPR系统的单碱基编辑工具，同时也在尝试改变spyCas9的PAM识别序列。而为了解决旁观者效应，哈佛大学的Gehrke等通过在A3A-BE3上引入新的突变，创造了新的eA3A-BE3单碱基编辑工具。eA3A-BE3更倾向于突变 TCR（R为嘌呤）序列中的胞嘧啶，且保留了较高的编辑效率。他们通过将eA3A-BE3的重组蛋白与化学合成的sgRNA复合物电转到β地贫患者造血干细胞中，精确地修复了HBB基因启动子上的单碱基突变而几乎不引起其他位点的胞嘧啶的转换。这个新的单碱基编辑工具解决了在基因治疗中单碱基编辑酶突变窗口过大可能引起周围其他位点同时突变的副作用，另外利用RNP的形式递送单碱基编辑工具也有效地解决了递送问题。

3 体外编辑细胞的适应性

除了针对造血干细胞进行基因编辑用于治疗血液和免疫缺陷类疾病，近来越来越多的报道将基因编辑系统作用于其他类型的干细胞。例如，GeraldSchwank等利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对体外培养的肠干细胞进行同源重组，对CFTR基因座进行了校正。校正后的等位基因在克隆扩增的类器官中表达出有功能蛋白，为单基因遗传缺陷患者原代成人干细胞同源重组基因校正提供了理论依据。2013年，Wu等将CRISPR/Cas9系统成功地应用于精原干细胞（spermatogonial stem cell，SSC），通过选择出携带所需基因型且没有脱靶突变的 SSC系，让携带纯合遗传缺陷的父亲可以100%产生健康后代，为父系遗传疾病的治疗提供了新的策略。然而，对于生殖细胞的编辑将会面临严肃的伦理道德问题，在这方面的伦理体系和长期安全观察结论完善以前，此类基因编辑仅仅只能停留在实验室研究阶段。

经过编辑的细胞移植到体内后的命运与基因治疗的疗效息息相关，若已编辑的细胞相对于未编辑的细胞具有更强的适应性，必将促使编辑后的细胞具有生长优势，如此即使编辑的细胞数量很少，移植到体内也可以起到治疗的作用。近期有报道指出，移植后的造血干/祖细胞一部分克隆可以独立于连续供应的上游多能祖细胞而存活，维持谱系偏向的输出，也就是说，有可能只要对这一小部分的细胞进行编辑，便可以达到治疗效果。

4 基因编辑疗法的安全性

在基因治疗的发展历程中也曾发生过一些严重的安全问题，致使基因治疗的发展在很长的一段时间内停滞不前。2008年，JCI杂志报道了 4例因基因治疗而导致白血病产生的案例。这 4名患者都参与了一项利用逆转录病毒治疗重整联合免疫缺陷（SCID-X1）的临床试验。虽然感染了逆转录病毒的CD34+细胞的确将健康的IL2RG基因带入了患者体内且达到了治疗SCID-X1的效果。但是由于病毒载体自身带有增强子元件，病毒随机整合到了LMO2（3例）和CCND2（1例）这两个基因附近，使这两个基因异常表达，从而导致白血病的产生。因此，如今在进行类似干细胞基因治疗时都有必要检测病毒载体是否在原癌基因处有随机的插入。

干细胞或 iPS细胞经过体外培养后可能累积潜在的致癌突变被认为是干细胞治疗的主要障碍之一。人类 iPS细胞的染色体不稳定性在2010年首次被报道，常见的是12号染色体三体，它可能有助于多能干细胞增殖和重编程的选择性优势，同时也是睾丸生殖细胞肿瘤的标志。2014年，1名患有渗出性年龄相关性黄斑变性（exudative agerelated maculardegeneration，AMD）的日本女性移植了由自体皮肤成纤维细胞经 iPS诱导后分化成的视网膜色素上皮细胞，这是基于iPS细胞的细胞疗法首次在人体进行临床试验。然而1年后，RIKEN叫停了这项试验，因为他们在给第 2位患者移植之前在iPS细胞中发现了突变，突变包括3种单核苷酸变异（SNV）和3种拷贝数变异（CNV），其中1个SNV列在癌症体细胞突变的数据库中，与单一癌症有关。尽管当时经移植治疗的第 1位患者并没有表现出严重的副作用，但相关研究者仍表示需要小心跟踪患者足够长时间观察任何不良细胞的生长情况。除此之外，干细胞的致癌性也有可能是由微环境和干细胞的突变共同引起，2014年，1名患有急性髓性白血病的日本男性接受了HLA匹配成功的外周血干细胞移植，但在27个月之后，白血病复发，经诊断复发是由供体来源的IDH2和DNMT3A突变造成的。虽然这两种突变在供体中尚未造成白血病，但由于移植后骨髓扩增迅速以及患者同时接受免疫抑制治疗，这两点造成了免疫监控系统缺陷，导致了供体白血病细胞在移植后的受体中迅速发展。

对于基因编辑策略而言，最大的担忧是具有潜在的脱靶安全隐患。在干细胞中发生的低频脱靶可能并不会立刻导致相应的表型产生，但是从长远的角度看却埋下了隐患。尽管利用预测软件能够分析出与靶点相似的潜在脱靶位点，还是有研究表明，在一些非典型PAM位点或者与靶点相似度较低位点仍然有可能有脱靶现象发生。全基因组测序分析对于概率极低的脱靶现象也很有可能出现假阴性的结果。近几年，随着CRISPR/Cas9技术的发展也催生出了许多灵敏度极高 的体内、体外实验方法以帮助检测潜在的低频脱靶位点，例如DIG seq、Circle-seq、Guide-seq等。这些方法在临床治疗时的合理运用将会对临床实验的安全性起到重要的作用。

5 展望

回想半个世纪以前，人类刚刚开启破译遗传密码的旅程，对于多种遗传病的病因还毫无头绪。而如今我们已经能够编写遗传密码、修复一些致病DNA突变。ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9这些工具的迭代出现帮助基因编辑领域取得了长足的进步。随着这些进步我们关注的焦点也已经从发现病因逐渐转向了运用新的技术和工具治愈这些遗传疾病。在这之中，效率和安全问题一直是我们关注的两大焦点。在效率问题上，一方面可以通过改进或选取合适的递送方式提高基因编辑工具进入细胞的绝对量。例如针对不同的靶器官选取不同的AAV类型；利用电转RNP的方式提高细胞体外编辑的效率同时降低脱靶；选取合适的纳米材料递送mRNA形式的基因编辑工具等。另一方面科研人员也在对人工核酸酶系统进行不段的优化，大范围核酸酶与TALEN技术的联合运用；CRISPR系统 PAM 序列的拓展以及新型CRISPR工具的不断开发；sgRNA与供体 DNA的不同修饰，这些都有助于提高核酸酶产生DSB的效率或者拓展新的位点。在安全性上，人们也在不断开发新的“保真型”CRISPR工具从源头降低脱靶概率，而不断出现的新型脱靶检测技术也有助于研究员检测和筛选编辑后的细胞。同时我们也必须看到CRISPR系统带给我们的并不仅仅是一把DNA剪刀，通过不同的融合蛋白，它还能够进行单碱基编辑、基因表达的调控和表观遗传修饰。结合不同的遗传疾病拓展这些新工具向临床领域的转化，关乎到是否有更多的遗传疾病能够从基因治疗领域获益。当然针对不同的新工具还必须开发相应的安全评价体系。虽然在短期内我们还不能做到高效、安全地靶向人体内的各个器官，但是干细胞离体分离技术和类器官离体培养技术已经逐渐发展起来。如今除造血系统之外，肝脏干细胞、小肠干细胞和它们各自的类器官培养技术都日趋完善，如何将基因编辑技术和这些技术联合起来将会是基因编辑向临床基因治疗转化的关键因素之一。对于细胞介导的基因治疗而言，除了血液系统可以进行有效的移植和重建外，如何将编辑改造后的细胞有效地整合到实体器官也是今后要重点研究和探讨的科学问题。

基因编辑的兴起，改变了以往对基因和细胞疗法的定义，为解决许多疾病提供了新的思路和契机，但基因编辑介导的细胞治疗仍面临着安全性的挑战，随着新工具的开发和利用，这些技术上的问题都将会得到解决。技术的进步往往推动伦理的发展，这就要求科学家恪守伦理道德，合理利用基因编辑工具造福人类。■

（摘自《中国细胞生物学学报》2019年第4期）