化学

气相色谱-串联质谱法快速筛查测定中药材中144种农药残留

程志，张蓉，刘韦华，等

摘要：目的：鉴于我国目前中药材中农药残留的检测品种少、前处理方法落后、灵敏度和专属性不足、容易在检测过程中出现假阳性和假阴性的现状，旨在建立起一套结合气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）技术和QuEChERS前处理法、对中药材中多种农药残留同时检测的方法，并应用该方法在人参、西洋参、黄芪、当归、金银花、枸杞、茯苓、牡丹皮、甘草、白术、枇杷叶等11种常见中药材中进行农药残留筛查测定，方法的适用性和实用性较高，为中药材中农药残留的检测提供了一种快速、高效、可靠的分析方法。方法：实验分为2个部分：样品前处理和仪器检测。首先，称取样品后用水浸润，加入0.1%的乙酸乙腈溶液超声提取，离心后提取上清液，于30℃下旋转蒸发至近干。以甲苯复溶，用 PSA、C18和适量 GCB净化提取液，过膜后采用GC-MS/MS进行色谱分离和质谱检测。进样时运用程序升温气化（programmed-temperature vaporization，PTV）的方式，试样经DB-5MS色谱柱分离后，采用选择反应监测（SRM）模式进行监测。结果：（1）选用选择反应监测模式对144种农药进行扫描，根据保留时间将扫描分为7个扫描窗口，使每个窗口内扫描离子适中，并调整离子对扫描时间（scan time），保证每个化合物数据采集点在 15个左右且响应值满足要求。（2）针对复杂样品中基质效应较大、干扰检测的情况，通过比较化合物的基质效应因子（matrix factor，MF）发现克菌丹等农药具有明显的基质增强效应，而乙酰甲胺磷等则具有基质减弱效应，针对同一农药在不同样品中基质效应不同的状况，使用对应的空白基质溶液配置标准曲线的方式较好的减弱了基质效应对目标物的影响。（3）由于144种农药化学性质各异、且中药材中含糖类、氨基酸及多种活性成分和挥发性物质，所以要求提取溶剂对农药有足够的溶解性和一定的选择性。考察了6种常见溶剂，通过比较提取液颜色、提取液质谱检测背景干扰和样品添加回收率发现，乙腈具有提取杂质少、提取液背景干扰较小和添加回收率较高等特点，因此选择乙腈作为提取溶剂。（4）通过研究乙腈直接提取和添加缓冲盐后乙腈提取的添加回收率，选择了乙腈-乙酸钠（0.1%乙酸乙腈+乙酸钠）的提取体系，该提取体系较AOAC经典方法降低了 10倍的乙酸用量，在保证了添加回收率的同时、降低了对进样口和色谱柱的酸腐蚀破坏。（5）在比较了多组QuEChERS吸附剂组合和用量的实验基础上，选择了PSA+C18（200 mg+200 mg）作为人参等含色素较少中药材的吸附剂，对当归等色素较多的中药材则在此基础上添加10 mg GCB加以净化。结论：建立了一套适用于多种常见中药材中 144种农药残留检测的GC-MS/MS方法，该方法应用了QuEChERS法对样品进行前处理，相关农药的LOQ在10～30 μg/kg之间、均低于现有残留限量标准，方法精密度在0.5%～14.6%间，可以满足当前中药材中相关农药的分析要求。该方法经过在模拟阳性样品和人参等34份实际样品上的应用，所得结果与 SPE-GC/MS方法的实验结果相互对比，结果基本一致，说明本方法具有较好的准确性和适用性。该方法选择性好、灵敏度高，方法定量限满足国内外药典对药材中农药残留的检测要求，为中药材中农药残留的监控、风险评估等研究提供了一种快速、高效、可靠的分析手段。

来源出版物：色谱, 2014, 32(1)： 57-68

入选年份：2016

固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中4种有机磷农药及其代谢产物

刘永，唐英斐，宋金凤，等

摘要：目的：有机磷农药检测大都局限于农药母体的检测，很少关注农药代谢产物的同时检测，而有些有机磷农药代谢产物在食品中残留富集对人体造成的伤害，甚至远高于有机磷农药本身。有机磷农药代谢物的检测，常局限于某一种化合物的检测，或者是几种可能代谢物的检测，不具有针对性，一般不能确定代谢物的来源，不能作为有机磷农药的标记物。农药及其代谢产物的检测，对食品安全具有更重要的价值，可能是未来农药残留检测的热点和难点。本文以菠菜和洋葱为研究对象，针对蔬菜种植中经常使用的有机磷农药马拉硫磷、甲基对硫磷、敌百虫及乙酰甲胺磷，对可能转化的主要代谢产物进行定量分析。方法：在蔬菜种植中经常使用的有机磷农药马拉硫磷、甲基对硫磷、敌百虫及乙酰甲胺磷，可能转化的主要代谢产物分别为O,O-二甲基二硫代磷酸酯、对硝基酚、敌敌畏及甲胺磷。根据蔬菜色素等基质的含量不同，叶菜以菠菜为试验样本。样品用组织捣碎机处理后，称取约5 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入2 g Mg2SO4、20 mL乙酸乙酯，均质器均质2 min（不低于10000 r/min），离心后取10 mL上层清液，过500 mg 6 mL活性炭和500 mg 6 mL弗罗里硅土串联固相萃取小柱净化。其它蔬菜采用弗罗里硅土固相萃取小柱净化。液相色谱柱选择HILIC色谱柱，乙腈和5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，增强极性化合物保留，分离效果较好，电喷雾正离子多反应监测模式检测。结果：蔬菜中通常提取试剂宜采用乙腈和乙酸乙酯，叶菜类蔬菜由于多数色素含量较高，而乙腈对叶绿素、叶黄素及胡萝卜素的提取效率高，提取液颜色较深，净化效果不好，采用乙酸乙酯进行提取，有利于去除大部分色素。固相萃取小柱分别采用C18小柱、活性炭小柱、氧化铝小柱及弗罗里硅土小柱进行试验。由于O,O-二甲基二硫代磷酸酯及对硝基酚极性较强，C18小柱保留效果不好，损失较大；氧化铝小柱对硝基酚的吸附作用较大，造成回收率不高。最终采用活性炭和弗罗里硅土串联固相萃取小柱对4种有机磷农药及其代谢物净化，效果较好，质谱基质效应均低于 45.1%。采用标准添加法进行回收率实验，选择3个不同水平，每个水平测定6次，样品的添加回收率为78.3%～99.7%；选择0.01 mg/kg作为添加水平，并进行6次平行实验，样品的RSD为4.16%～10.43%；8种标准品配制成标准系列溶液，定量限用样品基质中添加标准品的方式获得，定量限范围为 0.001～0.01 µg/mL，在 0.01～1.00 µg/mL范围内线性相关系数为 0.9982～0.9999。结论：色素含量高的蔬菜前处理采用活性炭和弗罗里硅土串联固相萃取净化方式，色素含量低的蔬菜用弗罗里硅土固相萃取净化方式，色素及其他杂质处理效果良好，经前处理的样品均为无色或浅黄色；液相色谱柱选择 ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱，增强极性化合物保留的同时，也起到了良好的净化分离作用，绝对基质效应较低。建立的4种有机磷农药及其代谢物的检测方法具有良好的回收率、精密度、线性范围和定量限，符合农产品中农药残留检测方法的要求，适合科研或日常工作中检测有机磷农药及其代谢物。

来源出版物：色谱, 2014, 32(2)： 139-144

入选年份：2016

基于“分段”-“完整”转化的G-四链体脱氧核糖核酸酶传感器用于多聚核苷酸激酶的检测

周璐，程慧，王金娥，等

摘要：目的：T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）可以催化ATP的 γ-位或 3′-单磷酸核苷的磷酸基团与寡核苷酸链（双链DNA和单链DNA或RNA）的5′-羟基基团进行转移和交换，实现寡核苷酸的5′磷酸化或者3′去磷酸化，在基因克隆、载体制备和核酸的损伤与修复中具有非常重要的作用。因此，发展快速、简单、灵敏的分析方法用于检测T4 PNK在疾病精准诊断和分子靶向治疗等研究领域具有重要的实际意义。在传感器的设计引入了由“分段”转化为“完整”G-四链体脱氧核糖核酸酶，利用释放的链（G-四链体脱氧核糖核酸酶），溶液中存在的hemin在K+存在下催化H2O2氧化ABTS的反应，引起体系的吸光度变化，从而实现对T4 PNK酶的检测。方法：酶反应实验：T4 PNK实验每个样品的总体积为2.0 μL：其中链 S2OH，20.0 μmol/L；ATP，1 mmol/L；T4 PNK 分别为 0.02，0.05，0.08，0.1，0.2，0.3，0.5，1.0，2.0 U/mL或者5 U/mL。将样品混匀后置于37℃水浴中反应30 min，再置于75℃水浴中失活10 min后冷却。再加入链 S1OH（20 μmol/L）2.0 μL，链 Helper DNA（20 μmol/L）2.0 μL，10×T4 连接酶反应缓冲液 2.0 μL，其余由灭菌水补齐。将样品混匀后置于 95℃水浴中5 min，再缓慢降至室温。再加入ATP（10 mmol/L）1.0 μL，T4 DNA连接酶2.0 U/mL。将样品混匀后置于22℃水浴中1 h，再置于75℃的水浴中10 min后，恢复至室温。再加入10×Exo III反应缓冲液3.0 μL，Exo III酶 2.0 U/mL，最后由灭菌水补齐，将样品混匀后置于37℃水浴中30 min，再置于75℃的水浴中10 min后，用于下一步吸光度测量。吸光度信号检测实验：向上述核酸外切酶 III实验的样品（30 μL）中加入 H2O24.0 mmol/L，Hemin 2.0 μmol/L，KCl 40 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，Triton X-100，0.008%和 ABTS1.0 mmol/L，其余体积由Hepes缓冲液（Hepes 20 μmol/L，pH8.0）补齐。其中ABTS在测量前加入，加入混匀后迅速测量样品的吸光度，取418 m处的吸光度值绘制相应的标准曲线并计算回收率。结果：首先验证上述T4 PNK传感器的可行性，对不同的体系进行了在Hemin和K+存在下催化 H2O2氧化 ABTS的反应，将体系的吸光度变化进行了比较研究。对Helper DNA的长度进行了优化，TP的用量进行了优化。利用上述传感器对T4 PNK酶进行定量检测，得到了工作曲线。同时用于实际样品中 T4 PNK酶的检测，并计算了回收率。结论：利用 G-四链体脱氧核糖核酸酶在 K+存在下可以与 hemin形成具有过氧化物酶性质的复合物，可以催化H2O2氧化ABTS反应，增加溶液的吸光度，进行了T4 PNK酶活性检测的传感器设计。该传感器可在0.02～0.3 U/mL浓度范围内实现T4 PNK的定量检测，检出限为0.014 mL，并完成了对两种细胞系的实际样本检测及标准液添加的回收率检测，各个浓度的平均回收率为95.6%～105.7%，实现了对T4 PNK酶的定量检测及对实际样本的灵敏检测。

来源出版物：分析化学, 2016, 44(1)： 13-18

入选年份：2016

定量核磁共振波谱法同时测定中药虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的含量

禹珊，郭强胜，王会琳，等

摘要：目的：虎杖作为常用中药已收入中国药典。白藜芦醇和虎杖苷是虎杖中两种主要药效成分，近年来测定这两种成分主要以HPLC和液相色谱质谱联用为主。定量核磁共振波谱法（qNMR）简单、快捷，实际样品测定时可以不使用待测组分的对照品，已先后被各国药典收录。通过对虎杖样品进行有效的提取和净化，用定量核磁共振波谱建立同时测定虎杖中白藜芦醇和虎杖苷。方法：虎杖样品以乙醇-水（4∶1，v/v）室温超声提取30 min，抽滤、旋干后再用丙酮两次超声提取净化后抽滤并旋干，精密称取并加入用基准物质邻苯二甲酸氢钾标定的 2,3,5-三碘苯甲酸为内标（标定时溶剂为氘代二甲亚砜-重水（4∶1，v/v）），在塑料离心管中超声溶于氘代二甲亚砜-重水（10∶1，v/v）混合溶剂，然后转移至核磁管用定量核磁共振氢波谱法测定。定量峰为6.388～6.391（白藜芦醇：d，2H）、6.322-6.330（虎杖苷：t，1H），8.329～8.332（内标2,3,5-三碘苯甲酸：d，1H）和 7.917～7.935（邻苯二甲酸氢钾：dd，2H）。核磁共振波谱（NMR）采集条件为：脉冲序列zg30，脉冲宽度14.4 μs。选择延迟时间5 s，扫描次数32次。测定样品的NMR谱图积分时，先将NMR谱图基线调平，选定峰积分区间，每个峰积分 3～5次，相对标准偏差（RSD）＜1%时取平均值。用中国药典2010版中的绝对定量公式计算含量。结果：通过考察实验条件对测定结果的影响选定样品提取与净化的预处理条件，以及氘代试剂、内标、采集参数等 NMR实验条件。归属了样品与内标NMR谱图中的各NMR信号峰。选定的定量峰不受附近峰的干扰，各定量峰的信噪比符合要求。对所建立NMR测定方法进行了方法评价。组分峰面积与内标峰面积比值的日内与日间精密度（RSD）均小于0.6%。以（样品/内标）质量比为横坐标（x），NMR定量峰面积比为纵坐标（y），用标定后纯品评价的零截距标准曲线分别为白藜芦醇：y＝4.4368x，相关系数 R＝0.9994；虎杖苷：y＝1.2885x，R＝0.9995，理论计算线性曲线的斜率对白藜芦醇为4.3797，对虎杖苷为1.2803。两者接近，可以直接用绝对定量模式测定。用线性回归曲线y轴截距的偏差与斜率计算定量NMR方法的检测限和定量限，白藜芦醇和虎杖苷的检测限分别为 0.23 g/L和0.24 g/L，定量限评价还考虑了英国药典中NMR峰信噪比大于150的要求，结果白藜芦醇为0.69 g/L，虎杖苷为1.57 g/L。样品提取后qNMR方法的回收率结果白藜芦醇为99.6%～102.3%（RSD＝1.0%，n＝6），虎杖苷为98.7%～101.1%（RSD＝0.9%，n＝6）。包括样品提取过程的回收率结果白藜芦醇为 97.7%～103.5%（RSD＝2.4%，n＝6），虎杖苷为 94.5%～99.2%（RSD＝1.6%，n＝6）。实际测定 4种虎杖饮片、超微饮片及配方颗粒样品中白藜芦醇含量为3.57～5.69 mg/g；虎杖苷含量为12.73～24.07 mg/g。结论：建立了qNMR同时定量中药虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的方法。所建立的样品提取方法稳定有效，定量 NMR方法精密度好，线性评价显示可以直接用绝对定量公式计算含量，定量准确。可用于虎杖实际样品的测定。

来源出版物：分析化学, 2015, 43(1)： 69-74

入选年份：2016

分子印迹固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中莱克多巴胺

黄怡，张青杰，刘敏，等

摘要：目的：莱克多巴胺（ractopamine，RAC）属于β-受体激动剂类药物，具有促进动物体内脂肪向蛋白质转化的作用，表现出营养再分配效应。RAC已成为目前非法使用较为严重的β-受体激动剂之一，被称为“第二代瘦肉精”。复杂生物基质试样中 RAC的前处理方法通常是采用传统的固相萃取小柱净化，不能有效去除基质共萃取物，从而影响目标分析物的分离分析。基于高选择性的分子印迹固相萃取（molecularly imprinted solidphase extraction，MISPE）技术，建立了高效液相色谱法测定各种饲料基质试样中莱克多巴胺的分析方法。方法：将 RAC溶解于乙腈-三乙胺（30∶1，v/v）体系的致孔剂中，加入丙烯酰胺（acrylamide，AM）功能单体，混合预聚合，随后加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）和引发剂偶氮二异丁腈（2,2′-azobisisobutyronitrile，AIBN），60℃聚合24 h，得到分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）。将制得的聚合物粉碎、过筛，沉降后，适量颗粒装入空小柱，制成MISPE柱，应用于饲料样品中RAC的净化和富集。制备的MISPE小柱经甲醇和水活化平衡，上样，依次用水和甲醇淋洗，5%氨化甲醇溶液洗脱。洗脱液吹干后用去离子水溶解，过膜上机检测。结果：考察了丙烯酰胺（acrylamide，AM）、4-乙烯吡啶（4-vinylpyridine，4-VP）和 2-乙烯吡啶（2-vinylpyridine，2-VP）为功能单体及甲醇、乙腈、丙酮和氯仿-甲醇与三乙胺等为致孔剂对合成聚合物识别 RAC的性能影响。结果：以AM为单体，乙腈-三乙胺体系为致孔剂制备的MIPs吸附、保留RAC明显高于其他合成体系，RAC回收率大于90%，且MIPs和NIPs之间差异显著。为此，进一步通过正交试验，以 RAC回收率为指标，优化了单体AM、致孔剂中三乙胺用量、交联剂EMDMA和引发剂AIBN之间的比率，获得最佳聚合配方为：1.0 mmol RAC，4.0 mmol AM，20.0 mmol EGDMA，6.0 mL乙腈-三乙胺（30∶1，v/v）和50 mg AIBN。优化合成条件下制备的聚合物电镜表征，聚合物表面形貌呈不规则的块状物，表面凹凸不平，有大量孔穴。采用 0.2%盐酸-甲醇提取饲料中RAC，吹干用水复溶，氨水调溶液pH至中性后上样，在优化的MISPE条件下，RAC在MISPE小柱上保留理想。与非印迹固相萃取（non-imprinted solid phase extraction，NISPE）和MCX小柱相比，MISPE柱具有更好的富集及净化效果，能有效消除饲料中复杂基质对RAC检测的干扰。此外，MISPE小柱对与RAC化学结构相似的克伦特罗和沙丁胺醇也具有较高的选择性，表现出簇特异性，回收率均大于80%，而与其结构差异大的甲基睾丸酮和恩诺沙星，回收率低于 5%。建立的基于 MISPE高效液相色谱测定饲料试样中莱克多巴胺的方法，在0.50～100 mg/L浓度范围内，RAC具有良好的线性，相关系数为0.9994。3种典型饲料样品在1.0、10及100 mg/kg三个浓度添加水平下，RAC的平均回收率为81.0%～97.4%，批内、批间相对标准偏差均小于10%，检出限为0.1 mg/kg。将建立的方法同国标方法（GB/T 20189—2006）进行比较，结果所示，两种方法测定结果差异不显著，但基于MISPE方法的净化效果明显优于国家标准方法。结论：以RAC为模板，AM为功能单体，EGDMA为交联剂，合成了对RAC及其结构类似物具有高选择性吸附的印迹聚合物，并建立了基于分子印迹固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中 RAC的分析方法。与传统固相萃取小柱相比，制备的MISPE小柱具有高的选择性，能获得更好的净化和富集效果。

来源出版物：色谱, 2012, 30(1)： 56-61

入选年份：2016