高效液相色谱-串联质谱法测定粮油中黄曲霉毒素B1

□ 宋寒寒 黄 浩 山东中质华检测试检验有限公司

1 前言

黄曲霉毒素B1（AFB1）对人畜的健康危害极大，所以对它的监控十分必要。目前食品安全国家标准规定食品中AFB1的测定方法依照GB 5009.22-2016，分别有同位素稀释液相色谱-串联质谱法、柱前衍生法、柱后衍生法、薄层色谱法和酶联免疫吸附筛查法。目前主要应用的是液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。本课题以粮油为基质研究AFB1的液相色谱-串联质谱检测方法，探究不同的条件对实验结果的影响，旨在简化前处理步骤、降低成本、提高检测结果的准确度。

2 实验部分

2.1 仪器、材料与试剂

Agilent Technologies液相色谱-串联质谱/质谱仪、湘仪高速冷冻离心机、北京普析纯水机、上海精科实业有限公司涡旋振荡器、Eppendorf单道微量移液器、美国Organomation氮吹仪、Waters固相萃取装置。

北京康源泰博生物科技有限公司黄曲霉毒素B1免疫亲和柱、BONNAAGELA TECHNOLOGIES Cleanert MC。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵为色谱纯；水为一级水；ANPEL AFB1外标（浓度为1 mg/L，-10 ℃贮存）；Biopure AFB1同位素内标（浓度为0.5 μg/mL，-18 ～ -22 ℃贮存）

2.2 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

用乙腈将AFB1标准品配制成浓度为20 μg/kg的使用液，转移至棕色标品试剂瓶中。用乙腈将AFB1内标配制成浓度为50 μg/kg的使用液，转移至棕色标品试剂瓶中。以上标品使用液的贮存条件为-18 ℃避光。将0.1%甲酸水溶液与乙腈以1∶9的比例混合，配置成稀释液，待用。AFB1使用液中加入稀释液，配制成0.5、1、2、5、10、20 μg/kg的系列标准溶液，其中每个标准溶液都含有0.5 μg/kg的AFB1内标。

2.3 仪器条件与方法设置

2.3.1 色谱条件

流动相A为0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈；梯度 A 相 为 90%（1～2 min），10%（2～5 min），90%（6～7 min）；流速0.4 mL/min；色谱柱为Agilent C18（2.1×50 mm、1.8μm、1200 bar）；柱温40 ℃。

2.3.2 质谱条件

母离子的选择：根据AFB1分子的化学电离性质，结合仪器条件与流动相的选择，离子化模式选为AJS ESI+。简化掉色谱柱的保留作用，通过直接进样法，进行母离子扫描。在一级全扫描状态下得到准分子离子，调节仪器碎裂电压（Fragmentor）使母离子丰度达到最大，确定AFB1的母离子质量数。

子离子的选择与优化：进一步进行子离子扫描，采集碎片离子信息，选择丰度较大、灵敏度较好且干扰较小的两对碎片离子作为定性子离子和定量子离子，并对子离子进行优化。设置一个合适的碰撞能量区间（可多次调整），其中能产生最高丰度子离子的数值即为最优电压，以达到最佳灵敏度。

2.4 样品前处理

2.4.1 提取

称取5 g样品于50 mL离心管中，加入相应标品使用液涡旋振荡混合后静置30 min。加入20.0 mL甲酸-水-乙腈溶液（比例为0.1∶15.9∶84），涡旋混匀，在9 000 r/min下离心5 min，取上清液备用。

2.4.2 净化

准确移取4 mL上清液，加入46 mL 1%吐温-20的PBS，混匀。将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温，待原有液体流尽，将样液移至免疫亲和柱上方的注射器筒中，调节至以1 mL/min的速度稳定下滴。样液过滤完后，再加入2×10 mL水淋洗、抽干。在亲和柱下方放置10 mL刻度试管，加入2×2 mL甲醇洗脱，控制1 mL/min的速度下滴。收集全部洗脱液，50 ℃下氮气吹干，加1.0 mL初始流动相定容，0.2 μm有机滤膜过滤，待进样。

3 结果与分析

3.1 色谱条件的优化

溶液经由电喷雾雾化，形成微小雾滴，进而电离。因此溶液的成分对AFB1的离子化效率有所影响。本实验对不同成分的流动相进行对比，结果显示当乙腈中加入适量的甲酸，创造出酸性环境，离子化效率较高，并且峰形较好、AFB1响应较高（见图1至图5）。因此，本实验选择0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵溶液与乙腈作为流动相。

图1 AFB1色谱图

图2 AFB1色谱图（含有甲酸）

图3 AFB1丰度比

图4 AFB1丰度比（含有甲酸）

3.2 提取液的优化

AFB1是极性较强的化合物，对于固态样品，可在研磨后直接使用提取液提取；对于液态样品，多为油脂类化合物，可采用萃取的方法提取。本实验使用不同的提取液多次重复试验，对样品的加标回收率对比，结果表明以甲酸-水-乙腈溶液（0.1∶15.9∶84）作为提取液时，回收率最高（见表1）。

表1 不同提取液对应的AFB1回收率

图5 AFB1质谱图

3.3 提取次数的优化

基质与提取液中的AFB1浓度总是存在一定的平衡关系，随着提取次数的增加，基质中的AFB1会被更充分的提取出来。通过提取1次、2次、3次、4次、5次的回收率对比，2次提取能明显的提高回收率，但是再继续提取，并没有相对等量的效果提升。结合时间、资源成本等考虑，以2次提取为最佳。

3.4 净化方式的优化

本实验对比了免疫亲和柱和Cleanert MC两种净化方法。免疫亲和柱是利用抗原抗体反应原理来进行化合物的筛选，针对性强，不能同时检测多种真菌毒素。Cleanert MC通用性强，使用方法简单，对应的实验室设备非常少。并且无需活化、洗脱、氮吹等步骤，一步过滤实现净化。两种方法均能达到85%～100%的回收率，结合操作方法、成本考虑，使用Cleanert MC更佳。

3.5 内标法的优化

本实验同时采用了内标法和外标法进行分析。在提取基质AFB1的过程中，经过容器、耗材的吸附以及部分溶液残留，AFB1的微量损失是不可避免的，内标法就是利用内、外标化合物的等比例损失，来消除这种误差。相比而言，外标法就与前处理及净化过程有关，操作步骤越简单、净化效率越高，则外标法回收率越高。通过加标回收试验对比，内标法的结果更加准确，外标法成本低、对环境的污染比较小。

4 结论

本文建立了粮油中的AFB1的液相色谱-串联质谱检测方法。该方法前处理步骤简单、条件易于控制、灵敏度高、准确性好、成本低廉，能够满足各个地区对AFB1检测的要求，适用于日常粮油中AFB1的检测。