晚期鼻咽癌组织eIF4E基因表达与放化疗敏感性的关系

俞艳萍, 费志强, 陆璐

1深圳大学第一附属医院、深圳市第二人民医院耳鼻咽喉科(广东深圳 518035); 2香港大学深圳医院骨科(广东深圳 518000)

鼻咽癌与其他头颈部恶性肿瘤不同，其发病与EB病毒相关且病理类型以低分化或未分化类型为主，极易发生转移而影响治疗效果[1-2]。鼻咽癌治疗以放射治疗(放疗)为主，近年来同步放化疗综合治疗在鼻咽癌中的应用亦较多，但疗效不一，有待进一步改善[3]。对鼻咽癌患者放化疗敏感性的早期评估有助于临床选取合理方法对鼻咽癌进行治疗，并改善其疗效。鼻咽癌的发生涉及多个基因的调节，真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)已被多个研究证实与鼻咽癌密切相关[4-5]。然而目前eIF4E表达与鼻咽癌放化疗疗效的关系研究仍较少。因此， 本研究检测了晚期鼻咽癌患者鼻咽癌组织eIF4E蛋白和mRNA表达情况，并分析了其与放化疗敏感性的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 取2007年1月1日至2008年12月30日于我院进行活检的30例晚期鼻咽癌患者鼻咽癌组织标本为癌症组。纳入标准：鼻咽癌组织标本来源患者均经病理检查确诊，鼻咽癌患者组织取样前未经任何抗癌治疗，性别不限，年龄≥18岁，TNM分期为Ⅲ期或Ⅳ期。排除标准：排除合并其他呼吸系统疾病、肝肾功能损伤、治疗前经抗癌治疗患者等。患者均符合纳入标准，且无患者排除。并以同期30例活检鼻咽黏膜慢性炎症组织为对照组，对照组患者亦均无其他明显内外科疾病。研究符合伦理学标准，且两组患者均已签署知情同意书。两组性别、年龄、体质指数、吸烟率等基线资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

1.2 治疗方法 癌症组患者均常规行放化疗综合治疗，患者均根据具体临床分期和耐受状况进行2～3周期的新辅助化疗，方案为顺铂100 mg/m3,d1～d3和紫杉醇135 mg/m3，d1静脉滴注化疗。此外癌症组患者亦均接受放疗，GTV-T 和GTV-N的PTVs剂量在66～70.95 Gy/31～33F，CTV-1高风险区(GTV外扩5～10 mm范围，包括鼻咽腔黏膜及黏膜下5 mm范围)PTV为60～66 Gy/30～33F，CTV-2肿瘤侵犯区域PTV为54～55 Gy/30～33F。

1.3 观察指标和检测方法

1.3.1 组织eIF4E蛋白表达情况检测 采用免疫组化法染色检测鼻咽癌组织和鼻咽黏膜慢性炎症组织eIF4E蛋白阳性表达率。将获得的标本均分成两等份，取其中一份通过甲醛溶液固定并行石蜡包埋，

项目例数性别(例)男女年龄(岁)体质指数(kg/m2)吸烟率[例(%)]癌症组30181247.22±13.8821.18±4.2622(73.33)对照组30201046.35±15.6920.98±3.8520(66.67)2/t值0.2870.2280.1910.318P值>0.05>0.05>0.05>0.05

将石蜡标本切制成厚度为4 μm连续切片后在二甲苯中浸泡10 min脱蜡，在100%、95%、90%、80%和70%浓度酒精中依次脱水去除二甲苯。3%过氧化氢溶液浸泡30 min后常规进行抗原热修复，滴加氧化酶阻断剂孵育10 min后滴加相应一抗，37℃保温30 min后在4℃冰箱中放置过夜。第2天取出后去除一抗，滴加相应二抗，37℃保温30 min后去除二抗，滴加辣根过氧化物酶标记抗生物素抗体37℃保温30 min后去除三抗，行苏木精染色后返蓝脱水，向标本滴加树脂并加盖玻片封片，在光学显微镜下观察照片，以细胞质出现棕黄色为染色阳性，以阳性细胞<50%为阴性，阳性细胞>50%为阳性，统计阳性表达率。

1.3.2 组织eIF4E mRNA 相对表达量检测 以GAPDH作为内参照进行实时定量PCR检测鼻咽癌组织和鼻咽黏膜慢性炎症组织eIF4E mRNA 相对表达量，取相应标本，常规提取总RNA，根据日本TOYOBO公司操作指导进行逆转录形成cDNA，引物序列见表2，常规进行实时定量PCR扩增反应，反应条件为95℃预变性5 min后进行32个循环的95℃变性3 min, 72℃退火30 s，32个循环后72℃延伸10 min，用三蒸水代替cDNA模版作为阴性对照，以GAPDH作为内参照进行检测结果分析，其中mRNA含量=2-ΔΔCT,ΔΔCT=CT目的基因-CTGAPDH。

表2 引物序列

1.3.3 疗效评价 放化疗完成后由主治医师根据放化疗敏感性评价标准分析癌症组患者放化疗敏感性。

1.4 评价方法 放化疗敏感性评价[6]：根据鼻咽和颈部淋巴结病灶的垂直直径变化进行放化疗敏感性评估，其中病灶完全消失为完全缓解(CR)，肿瘤最大垂直直径较治疗前减少50%以上为部分缓解(PR)，肿瘤最大垂直直径较治疗前增加25%以上或出现新病灶为疾病进展(PD)，介于PR和PD之间为疾病稳定(SD)，其中CR和PR归入化疗高反应，SD和PD归入化疗低反应。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件，计数资料比较采用2检验或校正2检验，计量资料均符合正态分布并采用独立样本均数t检验或校正t检验进行比较，采用Spearman相关分析法分析鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量与放化疗敏感性的关系，并采用诊断试验四格表和受试者操作特性曲线(ROC)分析鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量预测其放化疗敏感性的价值，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量比较 与对照组鼻咽黏膜慢性炎症组织比较，癌症组鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量均较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图1～2。

2.2 癌症组放化疗敏感性分析 癌症组化疗效果为CR、PR、SD和PD的患者分别为5例、17例、6例和2例，放化疗高反应和低反应患者分别22例和8例。

2.3 癌症组放化疗高反应和低反应患者的鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量比较 与癌症组放化疗高反应患者比较，放化疗低反应患者鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量均较高(P<0.05)。见表4。

表3 两组eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量比较

图1鼻咽癌组织eIF4E蛋白表达(SP，×400)

图2 鼻咽黏膜慢性炎症组织eIF4E蛋白表达(SP，×400)

放化疗敏感性例数蛋白阳性表达[例(%)]mRNA 相对表达量[(x±s)]高反应2212(54.55)0.891±0.062低反应88(100.00)0.968±0.0752/ t值2校正=5.455t校正=2.848P值<0.05<0.05

2.4 晚期鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量与放化疗敏感性的关系分析 Spearman相关分析结果显示，晚期鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量与其放化疗敏感性均呈负相关(r=-0.887、-0.895，P<0.05)。

2.5 晚期鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量预测其放化疗敏感性的价值分析 晚期鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量预测其放化疗敏感性的准确性均较高。见表5、6和图3。

3 讨论

近年来随着居住环境的变化以及生活方式的改变，各类呼吸系统疾病的发生率不断增加。鼻咽癌是常见呼吸系统恶性肿瘤，在我国南方城市的发病率较高[7-8]。

表5 晚期鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率预测放化疗敏感性的价值 %

表6 晚期鼻咽癌组织eIF4E mRNA 相对表达量预测放化疗敏感性的价值 %

图3晚期鼻咽癌组织mRNA相对表达量预测其放化疗敏感性价值的ROC曲线

由于鼻咽癌的发病位置隐蔽，且早期症状复杂而无特异性，鼻咽癌早期诊断率不高，多数患者确诊时已是晚期恶性肿瘤[9]。鼻咽癌的治疗以放疗为主，其对药物治疗不敏感，多数为改善全身症状和减轻放疗不良反应，而近年来新辅助化疗联合放疗在临床中的应用较多且可取得一定的效果[10-11]。但临床仍可见部分晚期鼻咽癌患者放化疗效果欠佳，甚至出现死亡等不良预后情况。本研究亦关注了晚期鼻咽癌患者放化疗敏感性，本研究结果显示，晚期鼻咽癌放化疗患者中有8例患者为低反应，疗效不佳，而在放化疗高反应患者中亦多数为PR，CR者甚少，晚期鼻咽癌患者放化疗敏感性较差，因此改善晚期鼻咽癌患者放化疗效果仍是目前急需解决的问题。

通过相关基因检测评估恶性肿瘤治疗效果和作为恶性肿瘤治疗依据为目前热门研究课题。鼻咽癌等恶性肿瘤的发生发展均涉及多个抑癌基因的失活和致癌基因的激活，其中eIF4E为促进其发生发展的重要基因[12]。eIF4E为24 kD多肽，在蛋白质合成过程中发挥限速蛋白的作用，在人类多种恶性肿瘤中均可见eIF4E过表达现象，而eIF4E过表达可导致各编码癌蛋白和促癌因子mRNA翻译表达的明显增强，促进癌症的发生发展。国内外均已有多个研究证实了eIF4E在鼻咽癌中的促进作用[13-15]。本研究亦检测了晚期鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量，结果显示，相对于鼻咽黏膜慢性炎症组织，晚期鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量均出现了明显的升高，进一步证实了eIF4E在鼻咽癌发生发展中可能发挥促进作用。

然而目前关于eIF4E在鼻咽癌疗效评估中的应用研究较少。本研究比较了癌症组放化疗高反应和低反应患者的鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量，结果显示，与晚期鼻咽癌放化疗高反应患者比较，放化疗低反应患者鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量均较高，提示晚期鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量与其放化疗敏感性可能相关。进一步的Spearman相关分析结果显示，晚期鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量与其放化疗敏感性均呈负相关，而诊断试验四格表和ROC曲线进一步分析证实晚期鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量预测其放化疗敏感性的准确性分别为60.00%和76.67%，对于eIF4E蛋白阳性表达和mRNA 相对表达量较高，尤其是高于0.816的晚期鼻咽癌患者需警惕放化疗效果不良，及时调整放化疗方案以改善疗效，减少鼻咽癌相关死亡等不良预后的发生。

综上所述，晚期鼻咽癌组织eIF4E基因表达水平较高且其高表达水平可能预示放化疗敏感性较差，需及时调整治疗方案以尽可能提高晚期鼻咽癌疗效，改善预后。然而本研究的样本量偏小，鼻咽癌组织eIF4E蛋白阳性表达率和mRNA 相对表达量检测可能受到患者合并疾病、取样和检测操作等多方面因素的影响，明确晚期鼻咽癌组织eIF4E基因表达情况与其放化疗敏感性的关系尚需进一步大样本量全面研究。