苹果浊汁云状颗粒体系稳定机制研究进展

朱丹实,任晓俊,魏立威,刘 贺,*,李贺文,曹雪慧,郭 迪,励建荣,*

(1.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013;2.锦州市三寅食品有限公司,辽宁锦州 121013)

我国是苹果生产大国,苹果产量连年攀升。2015年苹果产量已达4261.3万吨[1],同比2014年的4092.3万吨增加了4.13%。将苹果加工为即食的果汁产品,既可以提高商品的附加值,也可以满足人们快速生活节奏的要求。而稳定性不佳和易褐变一直制约苹果浊汁产业的发展[2]。在褐变控制方面,目前国内外主要通过加工过程中添加VC等抗氧化剂、减少氧气接触以及加热等手段控制酶促及非酶褐变[3-4]。而混浊稳定性方面,虽然可以通过均质、添加稳定剂、改变粒子的电负性等手段加以改善,但始终没有得到根本解决。

苹果浊汁富含的多酚及果胶类物质具有抑菌、抗氧化等多种生物活性[5-6],在抵抗心血管疾病、糖尿病、肥胖和癌症方面都表现出良好效果[7]。伴随浊汁的失稳,是营养物质的损失。研究表明,苹果浊汁对二甲肼诱发小鼠结肠癌具有明显的预防效果,而分离获得的苹果多酚单体无此功能;苹果浊汁在抑制致癌物诱导的上皮细胞增殖和DNA伤害方面比清汁更有效[8-9]。苹果果胶和多酚共同饲喂小鼠对其脂质代谢具有比单独饲喂更好的效果,说明二者具有一定的协同效应[10]。近年来,苹果浊汁的研究多集中在抑制氧化酶活性[11-12]及微生物的灭活[13-14]方面,而对苹果浊汁稳定性方面关注较少。本文综述了苹果浊汁中具有起云特性的云状颗粒物体系的构成,聚集和失稳过程,以及云状颗粒体系稳定的主要影响因素,可为提高和维持苹果浊汁的云状稳定性提供理论借鉴。

1 苹果浊汁云状颗粒体系的构成

苹果浊汁体系的溶剂主要由糖、果胶、有机酸及其盐溶液组成,颗粒体系一般认为是以带正电的蛋白质为核心,果胶分子吸附其上[15]。苹果浊汁中颗粒因光散射形成了果汁的混浊状态[16]。浊汁制备阶段形成的颗粒体系因尺寸较小及静电斥力作用可短期内稳定[17]。借助醋酸铀负染色电子显微镜发现浊汁雾状物主要是由大小不一的球状颗粒组成的支链状聚集体,如图1所示。

图1 负染色的苹果汁颗粒结构[18] Fig.1 Haze particle structures by negative stained formed in apple juice注:1a=1 μm;1b～1c=10 μm。

果汁云状颗粒体系构成具有相似性。对杨梅汁云状体系微观结构的研究表明,云状体系中颗粒为球形和椭圆形并被半透明膜包围。透射电镜研究表明,颗粒有三个亚结构,该“核心”和云状物的中间部分为多酚或 多酚/蛋白质复合物[19]。苹果浊汁颗粒物组分(Cloudy Particle Components,CPC)主要包括多酚、蛋白和果胶。不同原料来源苹果浊汁云状成分配比不同,总体来看,云状颗粒物组分CPC含量占30.0～72.5 mg/100 mL,其中蛋白为5.0～15.0 mg/100 mL,果胶为2.5～62.5 mg/100 mL,多酚类物质为11.0～17.5 mg/100 mL[8,20]。Zhao等[21-22]研究苹果汁膜过滤性能的影响中发现,苹果浊汁中胶体颗粒主要有两种尺寸,中心粒径分布分别为1和5 μm左右。苹果浊汁中可溶性果胶含量、蛋白质/酚类复合物的形成、酚类的氧化聚合等都影响CPC的构成和颗粒大小[23]。而CPC对于苹果浊汁的颜色、风味及流变学特性也起关键作用[24]。

苹果果胶是一类具有不同分子量的多糖。不同分子量的果胶有着不同的理化性质,如半乳糖醛酸含量、酯化度、黏均分子量、透光率、吸光度等均有所不同。果胶分子的主链是150～500个α-D-半乳糖醛酸基通过1,4糖苷键相连接而成的,在主链中相隔一定距离含有α-L-鼠李糖基侧链。气相色谱分析表明[25],苹果果胶中除了半乳糖醛酸外还含有8种单糖,分别为鼠李糖、岩藻糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。仇农学等[26]利用超滤法分离得到6种不同相对分子质量的苹果果胶,其中相对分子质量大于30万的占大多数,达到68.04%,相对分子质量在5000以下的较少,只有3.31%。苹果果胶随着相对分子质量的减小,果胶的半乳糖醛酸含量随之降低,但5000～10000 kD的果胶半乳糖醛酸含量较高。随着苹果果胶分子量的降低,酯化度也随之相应降低,但是各种分子量苹果果胶仍为高酯果胶。不同提取方法获得的苹果果胶性质差别较大,目前苹果果胶主要从苹果果渣中提取,而对苹果汁中果胶类物质的结构和性质分析研究较少。

苹果多酚包括多种酚类物质,可分为酚酸及其羟基酸酯类、糖类衍生物和黄酮类化合物(如儿茶素、表儿茶素、原花青素、二羟基查耳酮、黄酮醇配糖体等)[27]。陕西师范大学的邓红等[28]利用高效液相色谱指纹图谱技术鉴定了10个批次不同来源苹果浓缩汁中多酚物质,从多酚的12种共有峰中标定了7种单体酚,分别是没食子酸、4-羟基苯甲酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素和根皮苷。近年来,在根皮苷对苹果汁的褐变[29]及掺伪检测[30]方面研究较多。与苹果汁混浊相关的多酚只占苹果多酚的很少一部分。Siebert等[31]发现苹果浊汁沉淀物中有儿茶素和原花青素的聚合体[31]。苑博等人[32]利用超高效液相色谱(UPLC)鉴定出苹果汁中的主要多酚类物质分别为没食子酸(18.39 mg/L)和绿原酸(52.10 mg/L),在长期低温保藏其含量有所下降。而Ana L. Ramos-Aguilar等人的研究表明[33],在苹果汁加工过程中总酚和单体酚含量都有所增加。

起云活性蛋白(Haze-Active Proteins,HAP)是指和混浊有关的蛋白质,其自身或与酚类之间的相互作用是造成果汁后混浊的重要因素。蛋白质/酚类化合物的聚合也是澄清苹果汁后混浊的主要原因[34]。能形成此类聚合物的蛋白质只占其总量的一小部分,据报道,分子量12、15、28[35]、25[36]和36 kDa[37]的蛋白与苹果汁的后浑浊有关,且脯氨酸和羟脯氨酸等疏水性氨基酸含量越高,起浑能力越强[38]。

2 云状颗粒物的聚集及失稳

苹果浊汁中由多酚/蛋白/多糖构成的云状颗粒物组分(CPC)在贮藏过程中逐渐聚集、失稳,其聚合过程非常复杂。多酚具有多羟基结构使其具有较强的亲水能力,富含脯氨酸的起云活性蛋白与多酚通过氢键及疏水相互作用缔合[22],并对蛋白质的功能性质产生影响。Beveridge等[34]认为蛋白质和酚类化合物的聚合物是苹果汁发生混浊的主要原因。由于多酚的氧化,形成了一个复杂系统,其氧化物相互作用、相互交联,同时与蛋白质相互作用,形成了混浊和沉淀。氧化催化是形成蛋白质-酚类聚合物的关键因素,但聚合物的形成与蛋白质和酚类化合物的类型有关。大分子酚类化合物如缩合单宁是形成蛋白质-酚类聚合物的主要酚类化合物。蛋白质和多酚依据氢键、离子键、疏水键相互作用,二者的比例也影响聚合物的量。果胶与多酚通过氢键、疏水作用和静电作用相结合[39]。蛋白与果胶也可以通过共价和非共价相互作用,进而影响蛋白质的界面活性和其他功能性质[40]。

Siebert等[31]推测苹果浊汁中的儿茶素和原花青素首先通过自身聚合或者氧化,聚合体再与蛋白质相互作用,导致果汁混浊。茶饮料的后浑浊现象也主要是由于蛋白和多酚的聚集导致,对该体系的起浑过程研究较为深入。对茶饮料后浑过程研究表明[41],多酚/蛋白交互作用的第一阶段主要通过芳香环的堆叠产生的疏水作用形成可溶性的多酚多肽复合物;第二阶段,多个多酚分子与多肽结合,并通过分子间的协同作用形成多酚包被多肽状态,同时复合物大小倍增,并发生相变;第三阶段,少数多肽二聚体克服了分子间的电荷排斥而相互聚合;最终,复合物变成更大团聚体,并从液相分离沉淀。蛋白质和多酚的比例、pH及温度等都影响氢键、离子键和疏水相互作用的过程,进而影响聚合物的形成[42]。

Scollary等[43]研究了红酒中蛋白质、原花青素和多糖之间的相互作用方式,可为苹果浊汁CPC研究提供理论参考,如图2所示,虚线表明氢键位点结合,双箭头表示疏水相互作用区域。多糖和多酚间同样存在疏水相互作用,但作用位点尚不清楚。

图2 蛋白质、原花青素和多糖片段之间的相互作用示意图[43]Fig.2 Representation of interactions between protein,proanthocyanidin and polysaccharide fragments

苹果浊汁中CPC微粒在果汁这种胶体体系中震荡运动,不可避免地因相互碰撞增大其尺寸。此外,果汁中可溶性物质可能因多种复杂因素而转化成不溶的新颗粒,直接或间接促成或增大原有颗粒尺寸。因而,随贮藏时间的延长,苹果浊汁中CPC颗粒逐渐聚集成复杂的分形结构,进一步变大、沉降,其胶体颗粒结构见图3。同时,苹果浊汁中果胶类物质会随着储藏时间的延长和温度的升高而有所降解,结合其他因素使果汁的粘度降低,最终导致果汁变清、分层等混浊稳定性丧失现象的发生[45]。

图3 苹果汁胶体聚集颗粒的SEM图像[44](2 μm)Fig.3 SEM image of colloidal aggregates in apple juice[44](2 μm)

3 云状颗粒体系稳定的影响因素

从物理化学学角度来看,苹果浊汁体系可认为是胶体系统,其流变学特性取决于液相和固相特性。作为固相的CPC的颗粒尺寸、性状、容积率、电粘效应、果汁的修饰粘度等均影响胶体稳定性[46]。目前尝试保持浊汁稳定性的主要手段包括均质以降低颗粒粒径,添加稳定剂以增加果汁黏度[47],或增加果汁中悬浮颗粒负电荷以强化颗粒间斥力[16]。但降低粒径无法解决其在贮存期聚集增长的问题,通过添加稳定剂提高黏度改善浊汁稳定性也有局限,过高黏度会降低产品的感官品质。下面介绍几个较为重要的稳定性影响因素。

3.1 酸度

苹果汁的酸度对出汁率、风味、色泽、澄清度等重要参数均有影响[48]。苹果汁中的有机酸主要为苹果酸,并含有少量柠檬酸和奎宁酸[49]。Siebert等[42]认为多酚化合物主要与富含脯氨酸和羟脯氨酸的蛋白结合,形成蛋白-酚类聚合物,它的形成与pH、乙醇含量、温度有关。Yi等[50]认为苹果汁较低pH降低会加剧了多糖的水解作用。果胶类多糖作用于多酚/蛋白的聚集体,一定程度上可抑制其聚集沉淀。然而根据Zhao等[22]的研究,在低温、较低pH和高浓度条件下,随着果胶含量的增加,果胶颗粒之间也会通过氢键和疏水相互作用而发生聚集。

Thongkaew等[51]研究了多酚物质(儿茶素/丹宁)与乳清分离蛋白或乳清分离蛋白/果胶复合物的相互作用的机制,如图4所示,环境pH影响着多酚与蛋白的聚合进而影响蛋白质的沉淀,果胶与蛋白的可形成络合物从而减少蛋白沉淀。Mateus等[52]对葡萄籽多糖与蛋白相互作用的研究,认为其多酚保护机制有两种可能,一是带电多糖/蛋白质/单宁聚合形成三元复合物以增强溶解性;二是多糖与单宁发生分子缔合,从而竞争性抑制其与蛋白质的聚集。

图4 多酚(PP)与蛋白(P)及果胶(PE)凝聚物相互作用的可能机制[51]Fig.4 Possible mechanism implicating polyphenol interactions with protein and proteinepectin coacervates

3.2 离子强度及带电性质

对于苹果浊汁体系,分散的胶体粒子间的静电斥力和水合作用对苹果浊汁的粘度影响很大[53]。Benítez[17]研究了液体介质的pH和离子强度对苹果汁颗粒稳定性的影响,作者采用扩展DLVO理论对胶体相互作用进行建模,并成功应用于果汁稳定性和黏度的预测。Ellerbee等[54]对橙汁稳定进行性的研究发现,草酸铵通过螯合钙离子阻止因果胶分子交联而引起的混浊橙汁云状体系的失稳,橙汁粒子尺寸受pH和贮藏时间的影响,这说明除了盐桥作用,云状体系中颗粒间的非共价和非静电相互作用力同样发挥作用。根据Xiang等[55]的研究,苹果汁的带电性质对果汁的可溶性固形物、还原糖、总酚等也会有一定影响。

3.3 温度及酶的作用

温度会影响浊汁体系中酶的活性、蛋白与酚类物质的聚合、果胶的溶解性等,进而影响苹果浊汁的稳定性。虽然Paepe等[56]的研究表明,高温会使苹果浊汁中的酚类化合物降解,且温度越高降解越多。但是较高温度可以使有能力形成蛋白-酚类化合物的蛋白暴露更多的结合位点,从而形成更多的蛋白-酚类聚合物。苹果内源果胶甲酯酶(PME)可使果胶脱去部分甲基,使其拥有更多负电荷并紧密包裹蛋白质核,增强果汁的混浊稳定性。但是酶作用过度,则形成低甲氧基果胶易与金属离子形成凝胶而影响混浊稳定性。此外,低甲氧基果胶容易被苹果内源性果胶酶(PG)水解,蛋白质核暴露导致颗粒的静电聚集[3]。用商业果胶酶处理,虽然可提高苹果浊汁的得率和多酚含量,但会降低果汁粘度和云度[57]。

4 展望

苹果浊汁云状颗粒物组分主要包含蛋白质、多酚和果胶类多糖,但这些组分构成云状体系的具体形式尚不明确,其加工及贮藏过程中会失去稳定性而导致聚集的机理也未完全明晰,这些都需要科研人员继续深入研究。今后,苹果浊汁稳定性机理研究应重点从苹果浊汁三元复合体系的精细结构及失稳过程着手,如:云状颗粒体系的形成过程,蛋白/多酚/果胶的具体分子结构及交互作用方式,浊汁颗粒体系与溶液的作用关系及在溶液中失稳过程等方面开展深入研究。这些机理方面的研究,有助于揭示苹果混浊汁中云状颗粒物的结构及稳定性影响机制,为推动苹果混浊汁产业的快速发展奠定理论基础。