市售鲜肉中奇异变形杆菌的ERICPCR分型与耐药性分析

孙冷宁,陈善娇,王观杏,毕水莲,*

(1.广东药科大学公共卫生学院,广东广州 510006;2.广东药科大学食品科学学院,广东中山 528458)

奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)属肠杆菌科变形杆菌属,广泛存在于自然界,人类、家畜、家禽带菌率极高,是一种条件致病菌[1]。P.mirabilis极易引起肉类污染,且常由于肉类生熟交叉污染引起人体食物中毒[2]。近年来,由P.mirabilis引起的食物中毒事件在全国频繁发生[3]。

ERIC(Entrobacter repetive intergenic consensus)是主要存在于多种细菌基因组中的串联重复序列,ERIC-PCR技术是利用ERIC核心的高度保守序列设计引物进行PCR测定,其结果稳定、重复性好、分辨率高[4]、易于实现标准化,已被广泛地用于革兰氏阴性菌和阳性菌的分型及同源性检测[5],如大肠杆菌[6]、金黄色葡萄球菌[7]、沙门氏菌[8-9]、铜绿假单胞菌[10]等,但ERIC-PCR技术用于P.mirabilis尤其是P.mirabils食品分离株的分子分型和溯源的文献报道则比较少见[11]。

近年来,由于抗生素的大量及不合理使用,导致P.mirabilis耐药现象非常严重,已有多篇关于P.mirabilis耐药性的研究报道,但临床分离株与食品分离株之间、不同地区之间P.mirabilis的具体耐药分布差别较大,且鲜少有P.mirabilis食品分离株的基因型与耐药表型之间关系的相关研究报道。本研究主要针对中山市市售生鲜肉中分离的P.mirabilis,采用ERIC-PCR法进行分子分型,并进行药敏检测,对这些P.mirabilis食品分离株的基因型、耐药表型及其关系进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

71株P.mirabilis2016年10月从中山市某肉菜市场随机采集的猪肉、鸡肉和鸭肉中分离得到,由本实验室-80 ℃冻存;大肠埃希菌ATCC 25922 本实验室-80 ℃冻存;LB培养基、SS培养基、MH琼脂培养基 杭州天和生物试剂有限公司;Taq DNA聚合酶、10×Taq Buffer(Mg2+plus)、dNTPs(10 mmol/L each)、6×loading Buffer、DNA ladder Marker、Agarose Regular 宝生物工程(大连)有限公司;GoldView核酸染料 北京赛百盛生物工程公司;四环素类(四环素(Tetracycline,TCY)、强力霉素(Doxycycline,DOX))、青霉素类(青霉素(Penicillin,PEN)、阿莫西林(Amoxicillin,AMX)、氨苄西林(Ampicillin,AMP)、萘啶酸(Nalidixic,NAL))、氯霉素类(氯霉素(Chloramphenicol,CHL))、氨基糖苷类(链霉素(Straptomycin,STR)、卡那霉素(Kanamycin,KAN)、庆大霉素(Gentamicin,GEN)、壮观霉素(Spectinomycin,SPT)、丁胺卡那(Amikacin,AMK))、喹诺酮类(诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP))、磺胺类(磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole,SMZ)、甲氧苄胺嘧啶(Trimethoprim,TMP))、头孢菌素类(头孢曲松(Ceftriaxone,CRO))、大环内酯类(红霉素(Erythromycin,ERY))9类共18种抗菌药物纸片 根据目前国内外P.mirabilis耐药性的报道和临床用药指南选用,源自英国Oxoid公司;ERIC-PCR引物(ERIC1:5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′和ERIC2:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′[12]) 由上海生工生物工程公司合成。

C1000 Touch型梯度基因扩增仪、ChemiDOC XRS+超高灵敏度化学发光成像系统、PowerPac Basic电泳仪 美国Bio-Rad公司;Micro17R型微量冷冻离心机 美国Thermo公司;D1008E型恒温金属浴 上海一恒科技有限公司;GHX-9270B-2型隔水式恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司;CHA-SA型恒温振荡器 江苏常州朗越公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模板DNA的提取 复苏71株P.mirabilis分离株,分别在SS培养基上划线,37 ℃培养24 h,挑取单菌落,接种至3 mL LB液体培养基中过夜增菌培养,取1.5 mL增菌液至Eppendorf管中,12000 r/min离心5 min,弃上清液,加入无菌超纯水反复抽吸洗涤,12000 r/min离心3 min,弃上清液,然后加入200 μL无菌超纯水,充分混匀,100 ℃煮沸20 min后,12000 r/min离心5 min,取上清液置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 ERIC-PCR分型 反应体系为20 μL,包含0.1 μL Tag DNA聚合酶(5 U/μL)、2 μL 10×PCR Buffer、0.4 μL dNTPS(10 mmol/L)、1.2 μL ERIC1(10 μmol/L)、1.2 μL ERIC2(10 μmol/L)、2 μL模板DNA和13.1 μL无菌超纯水。反应条件为94 ℃预变性5 min后,94 ℃变性30 s,44 ℃退火1 min,72 ℃延伸3 min,循环35次,最后72 ℃延伸10 min。扩增结束后,将产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像系统对电脉条带进行成像。再利用Quantity one软件对条带进行处理与分析。

1.2.3 耐药性检测 采用K-B纸片扩散法,参照2017年美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定的标准进行试验操作和结果判读。实验过程大致如下:挑取P.mirabilis单菌落,均匀悬浮于适量生理盐水中,配制成0.5麦氏浊度的菌悬液,然后用灭菌棉签将菌液在M-H琼脂平板上均匀涂布,待平板稍干燥,用无菌小镊子将药敏纸片紧贴在平板表面,每个平板贴3～4片,35 ℃倒置培养约18 h后,观察结果。试验全程用大肠埃希菌ATCC 25922作为药敏质控菌株,以确保试验的准确性。根据 NCCLS 标准对量取的抑菌圈直径作“敏感”、“耐药”、“中介”的判断,而后根据公式计算出敏感率、中介率、耐药率。

敏感率(%)=药敏结果为“敏感”的菌株数×100/总数

中介率(%)=药敏结果为“中介”的菌株数×100/总数

耐药率(%)=药敏结果为“耐药”的菌株数×100/总数

1.3 数据处理

药敏实验重复3次取其平均值,结果使用WHONET 5.6软件(世界卫生组织独立开发)进行统计处理,并通过Excel进行整理分析。使用Quantity One 4.6.2软件(Bio-Rad公司)构建UPGAMA系统发生树,实现对ERIC-PCR分型图的聚类分析和相似系数分析。

2 结果与分析

2.1 ERIC-PCR分型

按照ERIC-PCR的操作步骤,对71株P.mirabilis进行基因分型,应用Quantity One软件对ERIC-PCR图谱进行同源性分析,结果见图1。所有菌株都呈现出良好的多态性,条带数目在3～6之间,片段范围在100～3000 bp不等,相似系数为0.64～1.00。基因型相似性大于90%的菌株通常被视为相同型别,代表同一克隆株,因此,由图1可知,71株P.mirabilis的ERIC-PCR指纹图谱共分为50个基因型,其中P18a、P20a和P19b为同一基因型;C63b、C67b和C65a为同一基因型;C53a和P26a为同一基因型;D16b和C60b为同一基因型;D7b和P16b为同一基因型;C45a和P25a为同一基因型;C47a、C39b和P24a为同一基因型;C61a、P26b、P28a、C68a和P21a为同一基因型;C56b、D5a和C57a为同一基因型;C58a、C26a、D8a、C46a、C59a和P17a为同一基因型。其它40株P.mirabilis分别为不同的基因型。

图1 71株奇异变形杆菌ERIC-PCR分型系统发生树和耐药表型Fig.1 Phylogenetic tree of ERIC-PCR classification and resistance phenotype of 71 strains of P. mirabilis注:a.耐药类型用数字加字母表示,其中数字代表耐药的数量,字母代表相同耐药数量时不同耐药类型。

条带相似性在75%以上的P.mirabilis菌株可划分为A～I共9个簇。C、D、E、F和H簇各包含1个菌株;A、G簇各包含2个菌株;B簇包含3个菌株;I簇是优势的基因型别,包含59株P.mirabilis,占所有菌株的83.10%。

2.2 药敏结果

采用K-B纸片扩散法对71株P.mirabilis进行18种抗菌药物的药敏检测,根据CLSI标准判定实验结果,具体见表1。全部P.mirabilis菌株对STR和ERY均耐药。65株(91.55%)对SPT耐药,62株(87.32%)对SMZ耐药,57株(80.28%)对DOX耐药,54株(76.06%)对AMX耐药,53株(74.65%)对TMP和CHL耐药,52株(73.24%)对GEN耐药,49株(69.01%)对TCY耐药,37株(52.11%)对AMK耐药,30株(42.25%)对AMP、NAL和KAN耐药,29株(40.85%)对NOR耐药,28株(39.44%)对CIP耐药。所有抗菌药物中,CRO和PEN相对最敏感,敏感率分别为88.73%和83.10%。

表1 71株P. mirabilis药敏实验结果Table 1 Drug sensitivity results of 71 P. mirabilis strains

2.3 基因型与多重耐药模式

71株P.mirabilis均至少对3类及以上抗菌药物表现为耐药,因此全部为多重耐药株。其中,16株耐6～8种药物,27株耐9～11种药物,17株耐12～14种药物,9株耐15～17种药物,最为严重的是出现了2株全耐菌株(耐18种药物)。71株P.mirabilis的耐药分布具体见图1,可分为60种不同的耐药类型。

A、B、G簇内菌株耐药类型各不相同,I簇内除耐药类型为8B、9A、9C、12D、15A、18的菌株各有2株外,其它菌株耐药类型均不同;A、C和H簇分别有1株菌与I簇内1株菌具有相同的耐药表型,B簇有2株菌分别与I簇内2株菌具有相同的耐药表型;菌株C65a和C67b具有相同的基因型(相似性为0.93)与耐药类型,除此之外,所有基因型相同的菌株耐药类型均不同,所有耐药类型相同的菌株基因型也不同。

3 讨论

自1989年国内首次从病死肉鸡中分离到P.mirabilis,后续不断有关于从禽类中分离到P.mirabilis的报道[13]。近年来,由P.mirabilis引起的食物中毒的案例呈逐年上升的趋势[14],因此选择合适的分型方法显得尤其重要。本研究所选用的ERIC-PCR分型方法操作简单、快速、成本低,但也存在许多模糊不清的条带,使用Quantity One软件自动分析会有对条带误判的情况,需要人工校正,因此存在较大的主观性。在本次研究中,对一些模糊不清的条带人为的判定为无条带,所得到的条带数目在3～6之间。总的来说,71株P.mirabilis的基因型总体相似性较高,可能与所有菌株来源于同一肉菜市场的样品,该市场鲜肉档口少、位置均相邻,且采样时间相对集中等因素有关,存在P.mirabilis相互污染的潜在可能。

年华等[15]研究表明,P.mirabilis临床分离株的耐药情况比较严重,AMP耐药率最高,其次为复方新诺明,耐药率均为80%以上,CIP的耐药率为69.2%～73.4%,GEN的耐药率约为60%;CRO的耐药率约为40%。本研究中P.mirabilis食品分离株的耐药情况仍然较严重,但耐药分布有所不同。STR和ERY的耐药率最高,均为100%,CRO的耐药率最低,为11.27%,AMP的耐药率为42.25%,磺胺类的SMZ耐药率为87.32%,CIP的耐药率为39.44%,GEN的耐药率为73.24%。值得注意的是,本研究实验菌株仅为71株,样本数量相对不多,因此所得结果不一定能够准确反映出P.mirabilis食品分离株对各药物的耐药情况,但P.mirabilis严峻的耐药趋势值得引起高度重视。

自上世纪80年代起,就不断有多重耐药菌的报道[16],随着检测技术的发展,关于多重耐药表型与基因型之间关系的研究也逐渐增多,但至今未有充分的证据证明两者之间存在特定的规律与联系。本研究的结果也表明,基因型与耐药表型之间没有明显的相关性。基因型(簇)相同的P.mirabilis菌株,其耐药表型不一定相同;耐药表型相同的P.mirabilis菌株,其基因型(簇)也不一定相同。究其原因,可能是由于,耐药基因在不同P.mirabilis菌株或微生物之间的移动导致耐药的种类和菌株数量不断增加,使得菌株的基因型和耐药表型发生改变。耐药基因转移的方式可能是由质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-Lactamases,ESBLs)通过接合、转化、转导等形式获得或转移耐药基因,也可能是通过携带耐药基因的整合子或耐药基因岛的移动所引起。

4 结论

本研究中,中山市市售生鲜肉中分离的71株P.mirabilis菌株的基因型相似性高,相似性系数为0.64～1.00,以75%为界可分为9个簇。分离菌株的耐药情况严重,均为多重耐药菌,且至少耐6种药物,测试的18种抗生素中,对链霉素和红霉素的耐药率最高,均为100%;对青霉素和头孢曲松耐药率最低,分别为16.90%、11.27%。其基因型与耐药表型之间虽然没有明显的相关性,但是仍可为P.mirabilis引起的食物中毒溯源及药物治疗提供参考。关于奇异变形杆菌由基因主导的耐药机制还需要进一步的探讨和研究,为更好地防治多重耐药菌提供依据。