Box-Behnken效应面法优化板蓝根总黄酮的超声提取工艺及其抗氧化活性研究

梁艳妮，朱 佳，唐志书，孙晓春，刘世军，宋忠兴，王 征

（陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083）

板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，主产于江苏、河北，具有清热解毒、凉血利咽作用[1]。临床常用于温疫时毒，发热咽痛、流行性感冒、腮腺炎、急性扁桃体炎等病症，具有抗病毒、抗菌、抗炎、镇痛等药理作用[2]。板蓝根证实含有生物碱、木质素、神经酰胺、黄酮、有机酸类、蒽醌类、芥子苷类等近百个化合物[3-6]。有关板蓝根总生物碱及多糖的提取工艺研究较多[7-8]，但对于板蓝根黄酮的提取工艺研究仅有一篇[9]。黄酮类化合物因具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性受到广泛关注[10]。超声波提取法具有能耗低、效率高和不破坏黄酮分子结构等优点[10-11]。Box-Behnken效应面法采用多项式拟合各因素与响应值之间的函数关系，比正交实验设计结果更优良[12-13]。本实验拟通过单因素试验与响应面分析法优化板蓝根总黄酮的超声乙醇提取工艺，为板蓝根总黄酮的药理活性研究与开发提供参考。

1 材料

板蓝根（批号：20171101，产地河北）为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，购于陕西兴盛德药业有限责任公司，由陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定。芦丁对照品（批号：wkq16031602，纯度：HPLC≥98%），购自四川省维克奇生物科技有限公司；所用试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

UV-2600型紫外分光光度计（日本岛津公司）；KQ-300DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；GB204 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；FA2004B型万分之一电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；VaCo5低温冷冻干燥仪（Zibrus Technology）；HH-2型恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；FE-1000AD固体粉碎机（天津鑫博得仪器有限公司）。

2 方法

2.1 标准曲线的制作 以芦丁为对照品采用亚硝酸钠-硝酸铝法绘制标准曲线[14]。即精密称取芦丁对照品适量，60%乙醇溶解配制200 μg/mL的芦丁对照品溶液。精密量取1 mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL的对照品溶液分别置于25 mL容量瓶中，以空白为对照，加60%乙醇至8 mL振摇，各加5%亚硝酸钠溶液1 mL，振摇，静置6 min；各加10%硝酸铝溶液1 mL，振摇，静置6 min；各加4%氢氧化钠溶液4 mL，60%乙醇定容，摇匀，静置15 min，在波长510 nm测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线得线性回归方程 ：Y = 12.434 X- 0.003 5（r = 0.999 8），线性范围：8 ～ 64 μg/mL。

2.2 板蓝根总黄酮提取单因素试验 将干燥板蓝根药材粉碎，精确称取干燥的板蓝根粉末5 g于250 mL三角瓶中，在考察提取因素条件下（料液比、提取时间和乙醇浓度）加入乙醇水溶液，超声提取[11]（固定功率为300 W，提取温度为室温）一定时间，过滤，石油醚萃取后将下层溶液旋转蒸发浓缩至无水状，60%乙醇定容，摇匀为待测液，按照“2.1”项下方法测定吸光度，根据芦丁标准曲线计算总黄酮提取率，确定各因素适宜提取条件。

2.3 Box-Behnken响应面试验设计 根据单因素试验筛选的料液比、乙醇浓度和提取时间，采用Design-Expert. V8.0.6软件中Box-Behnken模型设计试验组，以料液比（A）、提取时间（B）、乙醇浓度（C）三个因素为自变量，将板蓝根总黄酮提取率作为响应值，进行响应面分析。Box-Behnken试验设计因素水平表见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平表

2.4 抗氧化活性测定 将采用最佳工艺提取的板蓝根粗黄酮配成质量浓度为12 mg/mL的水溶液，膜压差为80 kPa过0.2 μ陶瓷膜纯化除杂后作抗氧化活性测定。

2.4.1 DPPH·清除活性 按照陈智坤等[15]清除DPPH·的方法，向6支试管中分别加入 2 mL 6 mmol/L的DPPH· 乙醇溶液和2 mL 系列浓度的板蓝根黄酮乙醇溶液，充分混合，室温避光反应 30 min后测定在 517 nm处的吸光度 A实验；以等体积的无水乙醇代替板蓝根黄酮溶液测得吸光度为 A空白；以等体积的无水乙醇代替 DPPH·乙醇溶液测得吸光度为 A对照。DPPH·清除能力计算公式为：清除率（%）= [1 -（A实验- A对照）/A空白]×100%。

2.4.2 ·OH清除活性 参考汪荔等[16]清除·OH的方法，在6支试管中分别依次加入 6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，不同质量浓度板蓝根黄酮溶液 2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，摇匀，静置 10 min后再加 6 mmol/L水杨酸溶液 2 mL，摇匀，水浴 37 ℃保温 30 min 后于510 nm 处测得不同黄酮浓度下的吸光度 Ai；用水代替水杨酸乙醇溶液时测得本底吸光度 Aj，用水代替黄酮溶液是测得空白对照吸光度 A0。·OH清除率（%）= [1-（Ai-Aj）/A0] ×100%。

3 结果

3.1 单因素试验

3.1.1 料液比对板蓝根总黄酮提取率的影响 在超声功率300 W，乙醇浓度60%，提取20 min条件下考察料液比 1：10，1：15，1：20，1：25，1：30，1：35 对黄酮提取率的影响。从图1可以看出，板蓝根黄酮提取率随提取溶剂用量增大先增大后减小，在料液比为1：25时，总黄酮提取率最大。

图1 料液比对总黄酮提取率的影响

3.1.2 乙醇浓度对板蓝根总黄酮提取率的影响 在超声功率300 W，料液比1：25，提取20 min条件下考察30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇对总黄酮提取率的影响。从图2可以看出，板蓝根黄酮提取率随乙醇浓度增大先增大后减小，提取溶剂浓度与总黄酮极性相关，乙醇浓度为60%时总黄酮提取率最大。

图2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

3.1.3 提取时间对板蓝根总黄酮提取率的影响 在超声功率300 W，料液比1：25，乙醇浓度60%条件下考察超声10，15，20，25，30，35 min对总黄酮提取率的影响。从图3可以看出，超声时间对总黄酮的提取率影响也存在极值范围，随着超声时间延长杂质溶出量增大，超声时间20 min时总黄酮提取率最大。

3.2 响应面优化提取条件

3.2.1 响应面试验设计 根据表1中3因素3水平编码设计试验方案，结果见表2，方差分析结果，见表3。

图3 提取时间对黄酮提取率的影响

表2 Box-Behnken试验设计与结果

通过Design-Expert.V8.0.6软件进行回归分析，得到料液比、乙醇浓度和超声时间对板蓝根总黄酮提取率影响的二次多项回归方程：Y = 2.71-0.074A-0.047B-0.027C-0.018AB-0.16AC+0.029BC-0.20A2-0.099B2-0.15C2。从表3可知该模型极显著（P＜0.0001），失拟项检验P = 0.0513＞0.05，说明失拟项不显著。以上表明该二次方程模型拟合度好，实验误差小，能够准确反映3因素对板蓝根总黄酮提取率的影响，可以利用此模型对板蓝根总黄酮的超声提取工艺进行优化分析。从表3可看出，一次项A，B，C，交互项AC，BC，二次项A2，B2，C2对响应值影响极显著，仅交互项AB影响显著。比较各项F值可知各因素对响应值的影响大小为A＞B＞C，即料液比＞提取时间＞乙醇浓度。

表3 响应面回归模型方差分析

3.2.2 响应面图分析 通过多元回归方程作三维效应曲面图和二维平面等高线图，从图4-6可以直观分析三个因素之间的交互作用以及对总黄酮提取率的影响。

图4 料液比与提取时间对板蓝根黄酮提取率的响应面图和等高线图

图5 料液比与乙醇浓度对对板蓝根黄酮提取率的响应面图和等高线图

图6 提取时间与乙醇浓度对板蓝根黄酮提取率的响应面图和等高线图

由图4料液比与提取时间交互作用显示，料液比变化曲面比提取时间变化曲面陡峭；等高线沿料液比方向变化稍高于提取时间方向且呈椭圆形，表明料液比对响应值的影响比提取时间稍大，二者之间交互作用显著。由图5料液比与乙醇浓度交互作用显示，料液比变化曲面比乙醇浓度变化曲面稍陡峭；等高线沿料液比方向变化稍高于乙醇浓度方向且呈椭圆形，表明料液比对响应值的影响比乙醇浓度大，二者交互作用极显著。由图6提取时间与乙醇浓度交互作用显示，提取时间与乙醇浓度对响应值的影响相当，二者交互作用极显著。

3.2.3 试验验证 根据响应面分析确定超声提取板蓝根总黄酮的最佳工艺参数为：料液比为1：29，提取时间为18 min，乙醇浓度为55%，对应总黄酮提取率为2.60%。用上述最佳工艺进行验证试验，总黄酮三次平均提取率为2.56%，与预测值的相对误差为1.5%，说明所得最佳工艺条件稳定，具有实用价值。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 板蓝根黄酮对DPPH·清除作用 从图7可看出板蓝根黄酮对DPPH·的清除率随着浓度增大而增强，在2～20 mg/mL范围内呈一定量效关系。当板蓝根总黄酮质量浓度为20 mg/mL时清除率达80.30%。

图7 不同浓度板蓝根总黄酮对DPPH·的清除作用

3.3.2 板蓝根黄酮对·OH清除作用 从图8可看出板蓝根黄酮对·OH的清除率随着浓度增大而增强，在2～20 mg/mL范围内呈一定量效关系。当板蓝根总黄酮质量浓度为20 mg·mL-1时清除率达82.40%。

图8 不同浓度板蓝根总黄酮对·OH的清除作用

4 讨论

在提取工艺参数的优化中，影响因素和响应值之间往往具有高度非线性关系，响应面法通过设计有限次数试验，建立包括各因素一次项、平方项和交互项的多元二次模型，拟合因素与响应值间的全局函数关系。对影响响应值的各因素水平及其交互作用进行优化和评价，可快速有效地确定多因素影响的最佳条件，精度高，预测性好。本研究在单因素试验基础上，采用Box-Behnken效应面法设计试验以优化板蓝根总黄酮的超声提取工艺，建立的二次多项回归模型极显著，失拟项不显著，拟合度好，能够准确地反映料液比、乙醇浓度和提取时间对板蓝根总黄酮提取率的影响。利用此模型得到的板蓝根总黄酮超声提取最佳条件为料液比1：29，提取时间18 min和乙醇浓度55%，提取时间短，方法简便，黄酮提取率可达2.60%。由验证试验可知Box-Behnken效应面法得到的理论优化结果可靠。采用非线性拟合模型接近客观事实，效应面三维图使因素对指标的影响更为直观、方便。

0.2 μm陶瓷膜分离纯化后的板蓝根总黄酮对DPPH·和·OH的清除能力具有浓度依赖性，总黄酮浓度在20 mg/mL时对此2种自由基的清除率可达80%以上。板蓝根黄酮的强抗氧化性为其进一步的开发提供了理论依据。