不同基因分型乳腺癌中Caspase-3、XIAP、Smac表达情况及与临床病理参数的关系

王振威 肖 刚 刘 威 李小江 赵永魁

乳腺癌具有高度异质性特点，不同基因型乳腺癌患者治疗反应不尽相同[1]。研究表明[2]，细胞凋亡异常与肿瘤发生发展存在密切关系。天冬氨酸酶3(Caspase-3)[3]、X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)[4]、第二个线粒体衍生半胱氨酸蛋白酶激动剂(Second mitochondrial activator of caspase,Smac)[5]是细胞凋亡过程中重要调控因子，三者在乳腺癌组织中表达缺乏细致性研究。本研究旨在探讨Caspase-3、XIAP、Smac在不同基因分型乳腺癌中表达情况，及其与乳腺癌临床病理参数之间的相关性。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2015年2月至2017年2月于我院行手术切除治疗的73例乳腺癌患者为研究对象，所有受试者术前均未接受任何放化疗及内分泌治疗，年龄27～73岁，平均年龄(51.43±6.27)岁，根据国际乳腺癌共识(2013年)[6]进行基因分型，其中Luminal A型30例，Luminal B型12例，HER-2过表达型9例，BLBC型22例，高分化21例，低分化52例，TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期34例，Ⅲ期18例，有淋巴结转移者26例，无淋巴结转移者47例。

同期取20例癌旁正常乳腺组织(距癌灶边缘4 cm以上)作为对照组，本研究经本院伦理委员会批准，且标本采集符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 主要试剂

免疫组织化学(streptavidin-perosidase,SP)试剂盒、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒，购自于北京中杉金桥技术公司；Caspase-3、XIAP、Smac兔抗人单克隆抗体、PBS缓冲液，购自于上海天呈生物用品超市。

1.3 方法

乳腺组织标本离体后，立即使用液氮速冻，于-80 ℃冰箱保存备用。标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，制作4 μm石蜡切片，采用SP方法，DAB显色，应用SP试剂盒检测石蜡切片中Caspase-3、XIAP、Smac表达情况，阳性切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，具体操作严格按照使用说明进行。

结果判定：以细胞膜/细胞质/细胞核内染色呈现棕黄色颗粒者为阳性表达。阳性细胞所占比例评分标准：≤5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。染色强度评分标准：无色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。由二位病理医师双盲阅片，以细胞染色强度与阳性细胞所占百分比评分乘积进行统计学分析，以<1分为阴性(-)；≥1分为阳性(+)。

1.4 统计学分析

应用统计学软件SPSS 19.0进行数据处理，两组计数资料比较采用卡方检验，不同基因分型中Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表达水平比较采用非参数检验中Kruskal-Wallis H秩和检验，三者表达与乳腺癌组织病理参数之间关系采用Mann-whitney U秩和检验，Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表达之间相关性分析采用Spearman相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表达水平比较

乳腺癌组织中Caspase-3蛋白阳性信号主要定位于细胞质或者细胞核。Caspase-3蛋白在乳腺癌组织中阳性表达率为39.73%，明显低于癌旁正常乳腺组织阳性表达率90.00%，差异有统计学意义(P<0.05)。具体结果见表1。

表1 两组Caspase-3蛋白表达比较/例

乳腺癌组织中XIAP蛋白阳性信号主要定位于细胞质。乳腺癌组织中XIAP蛋白阳性表达率为86.30%，明显高于癌旁正常乳腺组织XIAP蛋白阳性表达率(40.00%)(P<0.05)，见表2。

表2 两组XIAP蛋白表达比较/例

乳腺癌组织中Smac蛋白阳性信号主要定位于细胞质及细胞膜。乳腺癌组织中Smac蛋白阳性表达率为31.51%，明显低于癌旁正常乳腺组织Caspase-3蛋白阳性表达率95.00%(P<0.05)。见表3。

表3 两组Smac蛋白表达比较/例

2.2 不同基因分型乳腺癌组织中Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表达水平比较

Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表达在Luminal A型、HER-2过表达型、BLBC型之间两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)。具体结果见表4。

表4 不同基因分型乳腺癌组织中Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表达水平比较结果(例，%)

2.3 Caspase-3、XIAP、Smac表达与乳腺癌临床病理参数的关系

Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表达与乳腺癌患者年龄、肿瘤大小、绝经情况无关(P>0.05)，与TNM分期、分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)。具体结果见表5。

表5 Caspase-3、XIAP、Smac表达与乳腺癌临床病理参数的关系(例，%)

2.4 乳腺癌组织中Caspase-3、XIAP、Smac表达相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，乳腺癌组织中Caspase-3与XIAP蛋白表达呈明显负相关(γ=-0.796,P<0.01)，与Smac蛋白表达呈明显正相关(γ=0.803,P<0.01)，XIAP与Smac蛋白表达呈明显负相关(γ=-0.712,P<0.01)。

3 讨论

乳腺癌是临床上女性最为常见的恶性肿瘤，全球范围内发病率呈明显上升趋势，给女性身体健康及生命安全造成了巨大威胁[7]。研究表明[8]，不同基因分型乳腺癌疾病进程、流行病学危险因素、治疗反应等不尽相同。目前临床根据PR、ER、HER-2、TNM分期、组织分级、淋巴结转移等肿瘤指标指导患者治疗，但寻找更为精确的新型分子标志物，为乳腺癌患者设计新型治疗方式，提高患者临床疗效，仍然是目前乳腺癌临床研究的重大难点及热点。

Caspase-3是1种重要半胱氨酸蛋白酶，处于机体细胞凋亡核心位置，其高表达水平可导致细胞凋亡，是机体中重要的死亡蛋白[9]。细胞凋亡途径中，各种起始因子最终在Caspase-3会合，引发细胞结构水解，导致细胞凋亡发生，Caspase-3作为细胞凋亡级联反应的必经之路，是细胞凋亡的1个关键调控点。研究表明[10]，Caspase-3在肝癌、结直肠癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中异常低表达，说明其活性抑制导致机体细胞凋亡发生障碍，细胞增殖与凋亡动态平衡失调，诱发肿瘤发生及发展。杨胜利等[11]研究结果显示，Caspase-3蛋白在原发性浸润性乳腺癌组织中呈异常低表达，Caspase-3参与原发性浸润性乳腺癌发生及发展过程，且与患者预后密切相关。本研究结果显示，乳腺癌组织中Caspase-3蛋白阳性表达率为39.73%，明显低于癌旁正常乳腺组织Caspase-3蛋白阳性表达率90.00%，与上述研究结果相一致。随后本研究对不同基因型中Caspase-3蛋白表达进行统计研究，结果显示，Caspase-3蛋白表达在Luminal A型、HER-2过表达型、BLBC型之间两两比较差异显著，提示Caspase-3蛋白表达与乳腺癌基因分型有关，肖刚等[12]研究支持本研究结果。

XIAP作为1种凋亡抑制蛋白，在机体多种正常组织中均有表达，且在肝癌[13]、乳腺癌等[14]多种恶性肿瘤中显著高表达。本研究结果显示，乳腺癌组织中XIAP蛋白阳性表达率为86.30%，明显高于癌旁正常乳腺组织XIAP蛋白阳性表达率40.00%，提示XIAP在乳腺癌组织中呈明显高表达，参与乳腺癌发生发展，与闫红等研究结果一致。XIAP在HER-2过表达型、BLBC型乳腺癌组织中阳性表达率高达100%，提示XIAP表达与乳腺癌基因分型密切相关，主要分布在HER-2过表达型、BLBC型乳腺癌组织中。Moraes等[15]研究结果显示，XIAP在乳腺癌中明显高表达，且与乳腺癌患者预后及耐药性有关。本研究结果显示，XIAP与乳腺癌患者年龄、肿瘤大小、绝经情况无关，与TNM分期、分化程度、淋巴结转移密切相关，与上述观点一致。Smac蛋白是Caspase家族线粒体激活因子，作为一种促凋亡蛋白在细胞凋亡过程中发挥重要作用[16]。XIAP与Smac之间存在相互关系，是细胞凋亡过程中重要调控点之一，正常状态下二者处于动态平衡状态，一旦平衡打破，则诱导细胞凋亡或者凋亡抵抗发生。本研究结果显示，乳腺癌组织中Smac蛋白阳性表达率为31.51%，明显低于癌旁正常乳腺组织蛋白阳性表达率95.00%，且Smac蛋白表达与乳腺癌基因分型存在密切关系，推测XIAP高表达及Smac低表达，从而抑制Caspase表达抑制肿瘤细胞凋亡，导致肿瘤恶性程度增高，发生转移及复发。Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表达与乳腺癌发生发展密切相关，推测三者有望成为早期诊断、评估乳腺癌恶性程度及预测预后的参考指标，具有较高临床价值。

综上所述，本研究结果显示，Caspase-3、Smac蛋白在乳腺癌组织中明显低表达，XIAP蛋白呈明显高表达，三者与乳腺癌基因分型、发生发展密切相关。本研究仍存在样本量较少，仅从组织学水平检测三者水平等不足之处，乳腺癌中Caspase-3、XIAP、Smac表达所涉及的具体信号通路，后续实验将进一步充分阐明。