X连锁中性粒细胞减少症1例报告并文献复习

孟 新 侯 佳 王 莹 刘俐嫔 刘璐瑶 刘丹如 孙金峤 王晓川

1 病例报告

男，6岁5月，发现粒细胞减少6年余，为求进一步诊治，于2018年4月就诊于复旦大学附属儿科医院(我院)临床免疫科。

既往史：患儿3月龄时因发热查血常规，首次发现WBC及中性粒细胞绝对计数(ANC)减少，其后6年间断随访血常规，WBC及ANC始终低于正常水平。患儿平素易出现无明显诱因发热，频率约每月1次，热峰39℃左右，热型不规则，对症处理后发热可缓解；反复发生上呼吸道感染、化脓性扁桃体炎、口腔溃疡，感染病原包括白色念珠菌、EB病毒、肺炎支原体。先后使用多种抗感染药物，包括阿奇霉素、美罗培南、哌拉西林他唑巴坦、头孢菌素类(包括头孢哌酮他唑巴坦、头孢唑肟、头孢他啶、头孢唑林、头孢尼西)，抗感染治疗后病情好转。3岁时于外院行骨髓细胞形态学检测，提示骨髓增生活跃低水平，粒系成熟障碍。曾注射重组人集落刺激因子(G-CSF)，效果不详。无乙肝、结核、伤寒等传染病史及其接触史，有芒果过敏史，无药物过敏史，无手术外伤史，无异物吸入史。

个人史：G1P1，足月顺产，出生体重3.2 kg，Apgar评分1、5 min均为10分。生后母乳喂养，4月龄起添加鸡蛋黄、粥等辅食，现普食，无挑食、偏食。2个月会抬头，6个月会坐，13个月会走，智力、体格发育同正常同龄儿。

预防接种史：未按时接种，就诊前已全部补种，未见不良反应。

家族史：父母体健，非近亲婚配，否认家族性遗传性疾病史。

体格检查：T 36.5℃，P 100·min-1,R 22·min-1，体重21 kg。神志清楚，精神可，发育正常，营养中等。全身皮肤未见皮疹、出血点及黄染。浅表淋巴结未及肿大。外耳道无分泌液，乳突区无压痛。唇红，口腔黏膜光滑，咽部充血，双侧扁桃体I°肿大，充血，无脓苔。呼吸平稳，双肺呼吸音粗，未闻及啰音。心率100·min-1，律齐，心音有力。腹平软，未及包块，肝脾肋下未触及，肠鸣音2～3·min-1。四肢末端温，脊柱、四肢无畸形。克氏征、布氏征、巴氏征阴性。

实验室检查：2017年8月17日至2018年5月30日共行21次血常规检查，其中WBC(2.15±0.5)×109·L-1，ANC(0.261±0.086)×109·L-1，患儿于2018年4月29日至5月30日每2周随访血常规，ANC未见周期性波动(图1)。淋巴细胞亚群分类计数示NK细胞减少(23.42×109·L-1，1.63%)。骨髓细胞学染色(图2)：骨髓有核细胞增生活跃低水平，粒红比为1.4∶1；粒系增生伴成熟障碍，部分细胞内可见颗粒增粗或可见空泡；红系及淋巴系细胞增生活跃，形态无明显异常；巨核细胞易见，血小板不少，簇状易见。

根据患儿临床表现，ANC减少、骨髓细胞形态学特点，临床怀疑先天性中性粒细胞减少症。外院血液遗传疾病基因筛查，提示WAS基因突变，致病性不确定。为进一步明确诊断，经患儿家长同意，对患儿及其父母进行WAS基因检测。

图1 WBC和ANC波动图

图2骨髓细胞形态学染色(瑞氏染色，×1000)示粒系成熟障碍

注 红色箭头示早幼粒细胞和中幼粒细胞

WAS基因Sanger测序验证：取患儿及父母新鲜肝素抗凝血各2 mL，用FlexiGene DNA Kit抽提全血基因组DNA，测DNA浓度约100 ng·μL-1，设计WASexon8-exon9上下游PCR扩增引物，PCR扩增WAS基因，HiSeq2000进行Sanger测序，FinchTV软件对结果进行分析(图3)。患儿X染色体9号外显子c.T881C(p.I294T)半合子变异，其母为携带者，其父该位点未发现变异。

WASmRNA检测：取患儿及父母新鲜肝素抗凝血各2 mL，分离PBMC(人外周血淋巴细胞分离液，购自天津灏洋生物)，Trizol法提取总RNA并检测RNA浓度后，逆转录成cDNA(PrimeScriptTMRT Master Mix，Takara)，设计qPCR引物(Forward Primer 5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTT-3’; Reverse primer 5’-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3’)，qPCR采用Takara TerraTMqPCR Direct SYBR®Premix推荐方案，Roche Light Cycler实时荧光定量PCR仪检测患儿及其父母WAS基因mRNA表达水平。以患儿父亲为正常对照，将其qPCR结果2-△△Ct设为1，母亲(携带者)为正常对照的0.60倍，患儿仅为正常对照的0.29倍，表明WAS基因p.I294T变异导致患儿该基因转录相对减少，携带者母亲的mRNA表达水平亦下降。

图3家系Sanger测序结果

注 黄色标记显示患儿c.T881C:p.I294T半合子变异，其母为携带者，其父该位点未发现变异

流式细胞术检测WASP表达：取患儿、患儿母亲及健康人新鲜血各1管，肝素抗凝分离PBMC，FACS buffer洗涤后与CD3抗体4℃孵育20 min，FACS buffer洗涤，加入250 μL FACS Staining Buffer重悬混匀，加入500 μL Cytofix/Cytoperm置于4℃反应30 min，Perm/Wash液洗涤，50 μL Perm/Wash液重悬后加入WASP抗体，4℃反应20 min，Perm/Wash液终止染色并洗涤，200 μL FACS buffer重悬后流式细胞仪检测WASP表达，FlowJo 软件进行数据分析。图4显示，患儿、母亲及正常对照细胞内WASP表达水平分别为74.5%、84.3%和93.7%。

图4患儿及其母亲WASP表达

注 A图为设门方法，B图为患儿、其母亲和正常对照的WASP表达结果

治疗与随访：患儿入我院后感染症状不明显，ANC低，予粒细胞集落刺激因子(G-CSF)后ANC可从0.14×109·L-1上升至1.25×109·L-1，最高可升至3.32×109·L-1，随访1周后外周血ANC再次下降。随访至2018年9月，患儿病情稳定，发热和感染次数减少，外周血常规ANC(0.17～0.33)×109·L-1。

2 文献复习

检索PubMed、中国知网、万方和维普数据库，检索时间从建库至2018年9月20日。英文检索关键词为“X-linked neutropenia”，检出542篇；中文检索关键词为“X连锁中性粒细胞减少症”，检出0篇。筛选WAS基因突变导致的XLN病例的相关文献23篇，排除重复报道病例后，共2个家系(比利时和爱尔兰)和3例散发病例(刚果民主共和国和日本各1例，另1例国别不详)，总计18例，共发现4个突变位点(L270P、S272P、I290T、I294T)[1-4,]，2001年欧洲报道了第1个XLN家系，2018年日本报道了第1例亚洲XLN病例[5]。

对国外报道的本文18例及本文患儿(共19例)进行了临床资料总结和分析(表1)。患者均为男性，Sanger测序均发现WAS基因GBD结构域突变，ANC减少占84.2%(16/19)，其中15例<0.5×109·L-1，单核细胞数量减少(13/18，72.2%)，WBC数量降低(9/14，64.3%)。淋巴细胞亚群分析显示，NK细胞数量均明显降低(16/16)，CD8+T细胞升高(7/16，43.7%)、CD4+/CD8+比值倒置(9/16，56.3%)。6例(54.5%)骨髓细胞学存在粒系成熟障碍，其中2例伴有染色体核型异常，2例伴红系/淋巴系发育异常，余2例仅有粒系成熟障碍。WAS基因功能获得性突变临床上主要表现为反复细菌感染(11/17, 64.7%),3例频率可达每年8～10次，1例表现为不明原因发热、2例无症状、3例ANC正常。患者基因突变常于成年后发现(10/14, 71.4%)，此前仅2例患者在儿童期即发现基因异常[5]，但其ANC处于正常水平，不能诊断为XLN。本文患儿是确诊年龄最小的XLN患者。

3 讨论

WAS基因突变常导致经典的Wiskott-Aldrich综合征(WAS)，以PLT减少伴体积缩小、湿疹及反复感染为临床特征，病情常较危重，多因严重感染和出血而死亡[6]。WAS基因突变还可导致临床表型较轻的X-连锁血小板减少症(XLT)和X连锁中性粒细胞减少症(XLN)。相关疾病不同临床表型与WAS基因突变类型不同有关，无义突变和缺失突变导致WAS蛋白(WASP)表达缺失，引起严重的WAS综合征；错义突变导致WASP表达减少，引起XLT或者较轻的WAS综合征；WAS基因功能获得性突变则会引起XLN[7, 8]。XLN较其他两种疾病表型罕见。

表1 WAS基因功能获得性突变患者的临床特征

注 G-CSF：粒细胞集落刺激因子；MDS：骨髓增生异常综合征；NA：未检查；URTI：上呼吸道感染；AML：急性髓细胞白血病；ANC：中性粒细胞绝对计数；WBC：×109·L-1；N：中性粒细胞；M：单核细胞；L：淋巴细胞

WASP可调节细胞内肌动蛋白骨架生成，从而参与多种细胞生命过程，如细胞迁移、黏附聚集、分裂增殖等。WAS蛋白家族包括WASP、N-WASP、Scar/WAVE和Bee1，分别具有不同的组织特异性表达，其中WASP仅在血液系统表达。WASP在非激活状态下，C端的VCA结构域与GBD结构域结合，称为WASP的自身抑制。Cdc42是Rho家族成员，具有GTP酶活性，通过与GBD结构域结合激活WASP和N-WASP[9]。当VCA与GBD结合被Cdc42破坏后，WASP游离C端通过激活Arp2/3复合体[10]，进而促进肌动蛋白聚合[11-13]。目前报告的XLN病例，其突变位点均位于WASP的GBD结构域，WASP自身抑制平衡被打破，造成Arp2/3复合体持续激活，导致肌动蛋白聚合异常，细胞极化异常，细胞凋亡增加，这在一定程度上解释了骨髓粒系成熟障碍[1-3, 14]。

XLN患者临床表现为ANC减少，部分患者有反复细菌感染，但与重型先天性中性粒细胞减少症(SCN)及经典WAS综合征患者相比，XLN患者感染相对较轻，导致了临床上容易漏诊及确诊年龄较晚[2]。研究报道，XLN患者唾液的中性粒细胞数量正常，XLN小鼠模型实验发现，由WAS功能获得性突变导致中性粒细胞过度激活，并向外周组织迁移增加[15]。这是否可以解释XLN患者虽然ANC数量低但感染并不严重的现象，有待进一步研究。

目前报道中对XLN患者的治疗主要参照SCN治疗方案，包括预防性应用抗生素和皮下注射G-CSF。G-CSF是快速升高ANC的最有效方法，可以明显改善患者预后和生存质量[16]，但是长期使用存在并发血液系统恶变的风险，以急性髓细胞白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)最为常见。国际重症慢性中性粒细胞减少症登记处(SCNIR)对长期大剂量使用G-CSF治疗SCN患者随访15年后发现，约22%转化为AML/MDS[17]。SCN患者长期使用G-CSF可造成CSF3R基因继发突变，该基因突变与血液系统恶变高度相关，在XLN病例中同样存在该现象[18]。2001年首次报道XLN家系的课题组[1]对该家系中5例患者长期随访，于2009年发现2例患者发生血液系统恶变[18]，其中1例患者33岁起使用G-CSF 0.3 mg，每周3次，6年后发生AML，同时发现CSF3R基因g.2425T>G(p.Y729)突变；另1例患者63岁开始使用G-CSF 0.3 mg·d-1，持续皮下注射2年后发生MDS-RAEB，并发现CSF3R基因g.2390C>T (p.Q718)突变造成的CSF3R翻译提前终止。鉴于婴儿期因粒细胞减少导致脓毒血症而夭折的风险较大，而长期使用G-CSF又有引起CSF3R继发突变和导致血液系统恶变的风险，因而有研究者建议预防性使用抗生素作为基本治疗手段，并在综合考虑风险与收益的基础上，建议婴儿期使用G-CSF[3]。总之，对是否使用G-CSF，仍有争议，目前尚无对G-CSF治疗无反应或行骨髓移植治疗的XLN病例报道。

本例患儿是国内报道的第1例因WAS基因功能获得性突变导致XLN的病例，外周血ANC持续减少、骨髓粒细胞成熟障碍是重要的临床诊断线索，基因检测发现WAS基因突变可以明确诊断。与经典WAS综合征引起WASP表达缺失或低表达不同，XLN患者的WASP仍可表达，也是临床上容易忽视的重要因素。因此，对临床上怀疑先天性粒细胞减少症的患儿，需警惕WAS基因缺陷。