miRNA-21调控PDCD4在恶性黑素瘤组织中的表达及意义探究

李 双 ，邱 静 ，穆 震 ，孙 颖 ，张 超 ，韦方丽

（1.莱芜钢铁集团有限公司医院，山东 莱芜，271126；2.泰安市疾病预防控制中心，山东 泰安，271000；3.泰山医学院附属医院，山东 泰安，271000）

恶性黑色素瘤是一种由皮肤和其他器官黑色素细胞产生的肿瘤，具有恶性程度高、易发生转移及死亡率高等特点[1]。皮肤恶性黑色素瘤在老年患者中多发，且近年来呈现增高的趋势，并且在儿童中也有报道，且随着年龄增长其发病率显著增加[2]。因此，探讨皮肤恶性黑色素瘤的发病机制，寻找有效的治疗方法，对于抑制肿瘤进展，改善皮肤恶性黑色素瘤的治疗效果具有重要意义。miRNA-21是一种单链小分子RNA，能够通过其结构的5’端序列与靶基因的3’端序列结合抑制靶基因的表达。有报道显示[3]，miR-21是一种原癌基因，在非小细胞肺癌、脑胶质瘤及肺癌中表达显著增加。与其相反，程序性死亡蛋白 4(programmed cell death 4，PDCD4)被证实是一种新的抑癌基因，PDCD4是miRNA-21的靶基因且被其负向调控。已有报道显示[4]，在肿瘤组织及细胞中过表达PDCD4能够显著抑制肿瘤的增长。因此，本研究选取2016年01月-2016年8月山东大学齐鲁医院皮肤外科手术切除的20例恶性黑素瘤组织及20例健康对照皮肤组织作为研究对象，探究miR-21调控PDCD4在恶性黑素瘤组织中的表达及意义，现汇报如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016年01月-2016年8月山东大学齐鲁医院皮肤外科手术切除的20例皮肤恶性黑素瘤组织及20例健康对照皮肤组织作为研究对象。恶性黑色素瘤患者组织经过外科手术切除并经病理学检测证实。所有患者术前均未接受放疗、化疗及生物靶向治疗，未合并其他恶性肿瘤。所得标本均迅速放置于液氮中保存。恶性黑素瘤患者中男12例，女8例；年龄26～69岁，平均（49.62±7.36）岁。对照组中男10例，女10例；年龄23～65岁，平均（50.64±8.94）岁。两组患者在年龄、性别等一般资料的对比上无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准，且所有患者均签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 仪器及试剂 主要仪器：AB StepOne Plus实时定量PCR仪购自Life Technology公司，型号PRISM7700；电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

主要试剂：Trizol 购自美国Invitrogen公司；RIPA（强）裂解液购自碧云天生物技术有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；One Step PrimeScript® miRNA cDNA Synthesis Kit、PrimeScript® 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScript® RT Master Mix Perfect Real Time均购自Takara公司；PDCD4及β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成；PDCD4及GAPDH抗体均购自Cell Signaling Technology公司。

1.2.2 Real-time PCR法检测恶性黑色素瘤中miR-21、PDCD4 mRNA的表达 将两组受试者的组织置于冰袋上，用镊子夹取10 mg左右的组织于1.5 mL 离心管中，加入500 μL Trizol，采用组织匀浆机将组织研磨打碎，4 ℃ 12000 rpm离心10 min，取上清加入另一新的离心管中。加入100μL氯仿，4℃ 12000 rpm离心10 min。将上层水相吸取到另一新的并转移至一支新离心管中，并计入同体积的异丙醇，室温放置10 min，4 ℃ 12000 rpm离心10 min。弃掉上清加入500 μL 75%乙醇溶液，4 ℃ 12000 rpm离心10 min。将上清弃掉并置于室温下风干管中液体，之后加入适量无核酶水（ddH2O），室温放置30 min复溶提取到的RNA。

采 用 One Step PrimeScript® miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara公司）试剂盒，按照产品说明书配制逆转录及PCR反应体系，miRNA-21及内参U6引物购于Takara公司。按照PrimeScript®1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara公司）试剂盒配制反应体系及进行逆转录反应，按照PrimeScript® RT Master Mix Perfect Real Time（Takara公司）试剂盒说明配制PCR反应体系，β-actin作为内参照进行荧定量PCR反应，PDCD4及β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 Western blot法检测PDCD4蛋白的表达同样夹取10 mg左右的病理组织，采用匀浆器匀浆，加入50μL组织裂解液，冰上反应30 min。4℃12000 rpm离心10 min，吸取上清于新的离心管中，并加入适量loading buffer，100℃煮沸10 min。之后通过电泳、转膜、封闭、敷一抗、洗膜、敷二抗及发光等过程，获得western blot条带。用Lab Works软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，根据目的条带灰度值/β-actin灰度值的比值计算每组目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，实验所得数据以均数±标准差（x±s）表示，独立样本采用t检验，单因素方差分析采用SNK-qSNK进行多样本均数的两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组受试者组织中miR-21和PDCD4 mRNA的表达

real-time PCR检测结果显示，与正常皮肤组织相比，恶性黑素瘤组织中miR-21含量显著增加（P＜0.05），而PDCD4 mRNA含量显著降低（P＜0.05），见表1。

2.2 两组受试者组织中PDCD4 蛋白表达比较

Western blot检测结果显示，PDCD4蛋白在健康对照皮肤组织和恶性黑素瘤组织中的相对表达量分别为1.04±0.18和0.35±0.26，由此可见健康对照皮肤组织中PDCD4 蛋白的表达水平显著高于恶性黑素瘤组织中，差异具有显著统计学差异（P＜0.05）。

表1 两组受试者组织中miR-21和PDCD4 mRNA的表达（±s）

表1 两组受试者组织中miR-21和PDCD4 mRNA的表达（±s）

组别 miR-21 PDCD4 mRNA对照组(n=20) 0.96±0.14 1.03±0.31恶性黑素瘤组(n=20) 4.64±2.25 0.33±0.18 t 7.300 8.733 P 0.000 0.000

图1 两组受试者组织中PDCD4 蛋白表达

3 讨 论

恶性黑色素瘤采用手术难以完全切除，且对放化疗等治疗措施不敏感，有报道称，恶性黑色素瘤晚期患者的中位生存期仅为6个月，5年生存率低于5%[5]，因此，探究黑色素瘤的发病机制是当务之急。

miRNA-21是一个最近报道较多的致癌miRNA，周启明等的研究结果显示，黑色素瘤患者的血清中miR-21的含量显著增加，且与一致黑色素瘤细胞的凋亡存在一定联系。有研究结果提示[6]，miR-21可能参与了恶性黑色素瘤的发生发展过程。Wang[7]等的一项meta分析显示，血清中循环miR-21是一种预测肿瘤发生的良好血清标志物，且其含量与预后相关，但在恶性黑色素瘤组织中miR-21的表达研究较少。因此，本研究测定健康对照组皮肤组织及恶性黑色素瘤皮肤组织中miR-21的表达，结果显示，恶性黑色素瘤皮肤组织中miR-21的表达显著增加。以上结论充分显示出miR-21参与了恶性黑色素瘤的发病进程。

PDCD4是一种调控程序性死亡的蛋白，能够诱导细胞正常凋亡，是一种重要的抗癌因子。更重要的是，有许多研究显示[8-9]，PDCD4作为miR-21的调控因子，在许多肿瘤的发生中起重要作用。段倞彦[10]等的研究发现，肾癌患者的肾癌组织及癌旁组织中，miR-21的表达均显著增高，而PDCD4的表达显著降低，两者表达呈现负相关的趋势，且与肿瘤分化程度密切相关。本研究结果显示，与对照组皮肤组织相比，恶性黑色素瘤患者皮肤组织中PDCD4的mRNA及蛋白水平显著降低。由此可见，PDCD4在恶性黑色素瘤患者的机体中呈现低表达的状态，且这种低表达可能与miR-21的负性调控相关。

综上所述，恶性黑素瘤组织中miR-21水平显著增加，而PDCD4 mRNA水平及蛋白水平显著降低，可能参与了恶性黑色素瘤的发病过程，为恶性黑色素瘤的临床治疗提供了科学依据，但两者之间的具体调控机制还需要进一步探讨。