芦荟凝胶对深Ⅱ度烫伤大鼠创面愈合及EGF、 bFGF 表达的影响

刘川玉， 唐建红， 何 洁， 肖胜军， 蔡蒋帆

（1. 桂林医学院附属医院， 广西 桂林541001； 2. 桂林医学院第二附属医院， 广西 桂林541199）

芦荟属百合科植物， 其种类达几百种， 但可供药用只有十余种， 以库拉索芦荟、 斑纹芦荟、 好望角芦荟最常用。该植物含有多种有效成分及药理作用， 民间广泛用于治疗各种疾病， 素有“百药箱” 之美称， 主要有糖类、 氨基酸、 维生素、 矿物质、 有机酸活性酶、 芦荟大黄素、 芦荟苦素、 芦荟丁等［1］， 其中芦荟多糖是主要活性成分， 具有促进创面愈合及组织修复、 减少疤痕形成、 保护黏膜、 抑菌抗炎、 抗病毒、 抗癌、 抗辐射［2］、 增强免疫力［3］、 降低血糖［4］等作用， 对各种组织创伤（尤其是烧烫伤） 疗效显著。

课题组前期研究表明， 将鲜库拉索芦荟研制成凝胶后可保持芦荟多糖含有量［5］， 并明确了其促进创面愈合、 减少疤痕形成的作用［6］。 本实验将芦荟凝胶外敷大鼠深Ⅱ度烫伤创面， 并检测烫伤组织修复过程中表皮生长因子（EGF）、 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 表达， 以阐明其促进伤口愈合的相关机制。

1 材料

1.1 动物 SD 大鼠80 只， 雌雄各半， 体质量（200±20）g， 由桂林医学院科学实验中心动物室提供， 生产许可证号SCXK （桂） 2013-0001， 动物使用及处理方法严格按照桂林医学院动物实验伦理委员会的要求进行。

1.2 仪器 电子天平； 细胞破碎仪； 旋转蒸发仪； -80 ℃超低温冰箱。

1.3 试药 芦荟凝胶采用鲜库拉索芦荟（桂林医学院药用植物园） 制备［7］， 方法为取新鲜叶适量， 洗净， 沥干， 去皮， 取出凝胶条， 搅拌成均匀叶汁， 超声破碎10 min， 过滤， 稀释， 芦荟液-75%乙醇（1 ∶3）， 将所得溶液于80 ℃中水浴30 min， 0.5%活性炭脱色， 减压抽滤， 滤液浓缩至原体积的1／10， 加入0.2% ～0.5% 亚硫酸钠， 即得。 成品质地均匀细腻， 为乳白色透明的混悬稠厚液体， 并对其性状、 离心实验、 酸碱度、 微生物限度、 多糖含有量、 稳定性等质量指标进行控制。

1.4 抗体及免疫组化试剂盒 EGF 抗体（sc-1343， 1 ∶

100 稀释）、 bFGF 抗体（sc-79， 1 ∶100 稀释） 均购自美国Santa Cruz 公司； 二抗及免疫组化试剂盒（SP-9001、 ZB-2306） 均购自南京森贝伽生物科技有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 采用水浴烙铁法致烫伤［8］。 固定大鼠四肢， 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉， 背部靠头颈处脱毛并消毒后， 将开水浴中煮沸15 min、 横断面约为2 cm×1 cm 的铁棒取出后迅速用纱布擦干， 一端紧贴大鼠背部皮肤持续7 s， 力度以铁棒横断面紧贴皮肤不形成皮肤凹陷为准， 使大鼠裸露的背部产生约10%的烫伤， 创面经病理证实为深Ⅱ度烫伤， 然后立即腹腔注射乳酸林格氏液5 mL 抗休克，由于背部烫伤部位大鼠未能舔食触及和搔抓， 故将烫伤创面开放以利于随时观察其愈合或感染情况。 将大鼠置于25 ℃室温、 50%相对湿度环境中， 分笼饲养， 自由摄食、饮水。

2.2 分组及给药 将80 只大鼠随机分成给药组和对照组，每组40 只。 给药组用芦荟凝胶外敷烫伤创面， 厚度1 mm，4 次／d； 由于芦荟凝胶为单方制剂， 没有使用任何凝胶基质， 故对照组用生理盐水外敷烫伤创面， 4 次／d， 用药后各组创面保持开放， 分笼饲养。 每次给药前， 生理盐水清洗创面以除去残留受试物， 连续用药24 d， 烫伤创面如有感染时用抗生素外涂（为不影响受试物吸收， 用抗生素时间与给药时间的间隔在4 h 以上）， 2 次／d。

2.3 指标检测

2.3.1 创面愈合率 烫伤后2、 6、 10、 14、 24 d， 将创面描记在半透明纸上， 以此为模板将质地均匀的硬纸片剪成同样大小来表示创面面积， 计算创面愈合率， 公式为创面愈合率＝ ［（开始烫伤面积-未愈合创面面积） ／开始烫伤面积］ ×100%。

2.3.2 EGF、 bFGF 表达 测量创面愈合面积后， 手术剥离大鼠背部烫伤创面皮肤组织， 福尔马林固定， 常规制成石蜡切片， HE 染色观察皮肤病理变化， 免疫组化检测组织中EGF、 bFGF 表达。 抗原修复采用柠檬酸盐热修复法， 免疫组化具体步骤按相关说明书进行。 EGF、 bFGF 以细胞黄染为阳性， 从每张免疫组化染色切片中随机选取5 个视野，输入Q550CW 图像信号采集与分析系统测定阳性细胞的平均灰度值， 以此反映伤口局部两者表达。

2.4 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行处理， 计量资料以（¯±s）表示， 计数资料以百分率表示， 配对资料用t 检验， 组间差异用单因素方差分析， 等级资料用Radit 分析。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 芦荟凝胶对大鼠创面愈合率的影响 与对照组比较，给药组大鼠创面愈合率显著升高（P＜0.05）， 随着时间延长两组差异更明显。 见表1。

表1 芦荟凝胶对大鼠创面愈合率的影响（%， ±s， n＝40）

表1 芦荟凝胶对大鼠创面愈合率的影响（%， ±s， n＝40）

注：与对照组比较，∗P＜0.05

组别 2 d 6 d 10 d 14 d 24 d对照组 10.12±3.10 16.23±4.11 24.36±3.62 34.35±4.26 51.21±4.61给药组 15.25±3.21∗ 26.36±4.35∗ 38.16±4.12∗ 55.52±3.14∗ 88.56±5.02∗

3.2 芦荟凝胶对大鼠EGF 表达的影响 EGF 表达于损伤交界处表皮细胞、 真皮成纤维细胞、 毛囊上皮细胞、 血管内皮细胞（图1）； 与对照组比较， 给药组大鼠EGF 表达显著高于对照组（P＜0.05）， 而且两组均在第6 天到达高峰， 之后逐渐下调。 见表2 （以灰度值表示）。

图1 芦荟凝胶对大鼠EGF 表达的影响（第6 天， ×400）

表2 芦荟凝胶对大鼠EGF 表达的影响（±s， n＝40）

表2 芦荟凝胶对大鼠EGF 表达的影响（±s， n＝40）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05

组别 2 d 6 d 10 d 14 d 24 d对照组 101.08±10.84 110.34±11.41 99.67±9.76 78.31±8.33 70.32±7.64给药组 132.56±12.15∗ 153.12±14.76∗ 132.23±13.43∗ 98.67±9.36∗ 87.78±8.21∗

3.3 芦荟凝胶对大鼠bFGF 表达的影响 bFGF 表达于损伤交界血管内皮细胞及血管平滑肌细胞（图2）； 与对照组比较， 给药组大鼠bFGF 表达在愈合早期（第2、 6 天） 显著升高 （P ＜0.05）， 愈合中期 （第10 天） 相 当 （P ＞0.05）， 愈合后期 （第14、 24 天） 反而显著降低 （P ＜0.05）。 见表3 （以灰度值表示）。

4 讨论

现代医学治疗烫伤的原则是在促进创面愈合的同时，尽可能减少疤痕形成。 芦荟具有抗菌、 消炎、 生肌、 促进伤口愈合、 减少疤痕形成等多种药理作用， 研究证实， 芦荟汁能促进大鼠深Ⅱ度烧伤皮肤愈合［9］， 并能减少创面愈合后疤痕形成。

图2 芦荟凝胶对bFGF 表达的影响（第6 天， ×400）

皮肤创伤愈合过程由表皮细胞分裂增殖、 纤维母细胞增殖并分泌细胞外基质来完成， 其中包括各种炎症细胞及细胞因子参与愈合过程。 烫伤皮肤的表皮修复依赖于周围正常表皮细胞分裂增殖覆盖损伤部位， 而表皮细胞的分裂增殖依赖于表皮生长因子， 其中EGF 是表皮细胞最主要的有丝分裂原。 本实验发现， 给药组、 对照组EGF 蛋白阳性表达的细胞分布一致， 均主要为损伤交界处表皮细胞、 真皮成纤维细胞、 毛囊上皮细胞、 血管内皮细胞， 这些部位是创面修复细胞的增殖活跃部位， 与文献［10］ 报道一致， 同时两组创面EGF 表达均于烫伤后第6 天达到高峰，以给药组更显著， 表明芦荟凝胶外敷可促进其合成和分泌。由此推测， 芦荟具有解毒、 消炎、 减轻组织水肿等功效，故减少损伤因子对EGF 分泌相关细胞（尤其是表皮细胞）有明显抑制作用， 从而增强其分泌相关细胞因子的能力。此外， 有研究发现芦荟粗多糖能促进人表皮细胞体外分泌EGF［11］， 而且通过影响表皮细胞的DNA 合成及细胞周期来促进细胞增殖［12］， 故芦荟还可能通过依赖或非依赖EGF机制来促进表皮细胞增殖和烫伤皮肤愈合。

表3 芦荟凝胶对bFGF 表达的影响（±s， n＝40）

表3 芦荟凝胶对bFGF 表达的影响（±s， n＝40）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05

组别 2 d 6 d 10 d 14 d 24 d对照组 99.05±10.12 108.13±11.31 107.21±9.21 88.31±8.01 50.08±7.24给药组 125.17±11.07∗ 143.12±14.15∗ 112.23±13.08 64.67±9.06∗ 32.05±4.42∗

bFGF 是纤维母细胞生长因子家族成员之一， 能促进细胞主要是纤维母细胞的分裂、 增殖， 促进血管生成， 因而在创伤愈合中起到重要作用［13］。 本实验发现， 在愈合早期（第2、 6 天） 芦荟凝胶外敷能促进bFGF 分泌， 而在愈合晚期（第14、 24 天） 反而下降， 这是因为早期损伤修复是通过肉芽组织， 即新生毛细血管和纤维母细胞进行； 晚期肉芽组织中毛细血管成熟并减少， 纤维母细胞转变为纤维细胞并产生胶原纤维， 即芦荟凝胶在早期促进组织修复，而在晚期由于修复较快而导致肉芽组织老化也较快， 故bFGF 表达下调， 其中芦荟多糖可能加速肉芽组织形成和老化而减少疤痕形成。

综上所述， 芦荟凝胶能促进深Ⅱ度烫伤大鼠EGF、bFGF 表达， 从而加速创面皮肤愈合， 本实验可为该制剂在烧烫伤方面应用提供理论依据和实验基础。