补骨脂酒制工艺的优化

叶斌斌， 敖楠楠， 姜明月， 曲 扬， 郑 彧

（辽宁中医药大学， 辽宁 大连116600）

补骨脂别名和兰苋、 胡韭子， 为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L. 的干燥成熟果实， 其性温、 味辛， 具有补肾助阳、 温中止泻、 纳气平喘之功效［1］。 但补骨脂温燥之性易伤阴助火， 故临床用药需对其进行炮制， 炮制方法始载于《雷公炮炙论》， 有雷公法、 酒浸炒、 清炒、 盐炙、蒸法等［2］， 目前其炮制工艺以2015 版《中国药典》 中所规定的盐炙法为主， 关于炮制前后成分种类及含有量变化的研究也大多为盐炙品［3-4］。

然而， 研究表明补骨脂经盐炙后香豆素、 黄酮、 单萜酚类成分均呈上升趋势［5］， 而补骨脂酚具有肝毒性和肾毒性［6-7］， 可能会对临床用药的安全性产生影响。 补骨脂酒制品古来有之， 但雷公制因其操作繁复性不利于工业化大规模生产， 课题组前期考察酒制法与雷公制所得指纹图谱［8］， 发现两者有效成分种类及含有量差异较小， 本实验通过Box-Behnken 设计优化补骨脂酒制工艺， 以期完善该工艺， 并为后续相关炮制机理研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 9030A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）； LC-10AT 高效液相色谱仪 （日本岛津公司）； DFT-50 手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）； KQ2200 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； AE240 电子分析天平（十万分之一， 瑞士Mettler-Toledo 公司）； HC-2518R 高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。

1.2 试药 补骨脂（产地安徽， 批号20160859） 及补骨脂素（批号140706）、 异补骨脂素（批号150422）、 补骨脂甲素（批号140904）、 补骨脂乙素（批号140515）、 补骨脂宁（批号150804）、 补骨脂定（批号140716）、 补骨脂酚（批号 wkq16061501）、 补 骨 脂 二 氢 黄 酮 甲 醚 （批 号150305） 对照品均由成都普菲德生物技术有限公司提供，含有量均≥98%。 乙腈、 甲醇为色谱纯， 由美国Thermo Fisher Scientific 公司提供； 水为超纯水， 由杭州娃哈哈集团有限公司提供； 龙泉黄酒 （产品标准号GB／T 13662-2008） 由大连长兴岛酒业有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 成分含有量测定（HPLC 法）

2.1.1 色谱条件 J＆K Chemical Ltd 色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm， S／N SJA702-05）； 流动相乙腈-水， 梯度洗脱（0～10 min， 5% ～45%乙腈； 10～45 min， 45% ～70%乙腈； 45～60 min， 70% ～100% 乙腈； 60 ～70 min， 100% 乙腈）； 体积流量1.0 mL／min； 柱温30 ℃； 检测波长220、250 nm； 进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量， 甲醇配制成一定质量浓度贮备液， 精密吸取适量置于10 mL 量瓶中， 甲醇稀释至刻度， 即得含补骨脂素0.18 mg／mL、 异补骨脂素0.09 mg／mL、 补骨脂甲素0.12 mg／mL、 补骨脂乙素0.222 mg／mL、 补 骨 脂 宁0.036 mg／mL、 补 骨 脂 定0.128 mg／mL、 补骨脂酚1.051 mg／mL.、 补骨脂二氢黄酮甲醚0.154 mg／mL 的溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末（过3 号筛） 约0.2 g， 置于25 mL 量瓶中， 70%乙醇超声1 h， 放冷， 定容至刻度， 摇匀后静置， 上清液离心， 0.45 μm 微孔滤膜过滤， 取续滤液， 即得。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 取“2.1.2” 项下对照品溶液， 稀释0、 1.25、 5／3、 2.5、 5、 10 倍， 在“2.1.1” 项色谱条件下进样10 μL 测定。 以溶液质量浓度为横坐标（X）， 峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 结果见表1， 可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.2.2 精密度试验 取同一份供试品溶液， 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6 次， 测得各成分峰面积RSD 为0.92% ～1.65%， 表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验 精密称取药材6 份， 按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定， 测得各成分峰面积RSD 为1.83% ～2.36%， 表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液， 在“2.1.1”项色谱条件下于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 进样测定， 测得各成分峰面积RSD 为1.57% ～2.19%， 表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率试验 精密称定含有量已知的药材粉末6 份， 每份约0.1 g， 精密加入各对照品， 按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次， 测得各成分平均加样回收率为97.23% ～101.52%， RSD 为0.99% ～2.06%。

2.3 酒制工艺优化 在预实验基础上， 选择烘制温度（A）、 加热时间（B）、 黄酒量（C） 作为影响因素， 采用Box-Behnken 设计确定三因素三水平， 因素水平见表2。 再称取17 份药材， 每份10 g， 以补骨脂素（W1）、 异补骨脂素（W2）、 补骨脂甲素（W3）、 补骨脂乙素（W4）、 补骨脂宁（W5）、 补骨脂定（W6）、 补骨脂酚（W7）、 补骨脂二氢黄酮甲醚（W8） 含有量为影响因素， 采用加权评分法优化酒制工艺［9］（设定满分为100 分， 由于补骨脂素、 异补骨脂素为主要有效成分［10］， 故其权重系数均设定为0.2，而其他6 种成分均设定为0.1）， 计算综合评分 （Y，0.2 W1／W1max×100 ＋0.2W2／W2max×100 ＋0.1W3／W3max×100 ＋0.1W4／W4max×100 ＋0.1W5／W5max×100 ＋0.1W6／W6max×100 ＋0.1W7／W7max×100＋0.1W8／W8max×100）， 结果见表3。

表2 因素水平

表3 试验设计及结果

通过Design Expert 8.0.6.1 软件进行多元回归分析，得到 方程为Y ＝86.44 ＋0.98A-0.85B-0.62C ＋0.48AB-1.27AC-0.07BC-1.25A2-1.63B2-2.33C2（R2＝0.914 6），方差分析见表4。 由表可知， 模型P＜0.05， 可用于预测；因素A （烘制温度）、 B （加热时间） 对综合评分影响显著（P＜0.05）， 而C 影响不显著（P＞0.05）。 响应面分析见图1。

表4 方差分析

2.4 验证试验 根据回归方程， 确定最佳酒制工艺为每100 g 补骨脂中加入17.36 g 黄酒， 169.25 ℃下加热烘制9.08 min， 为了便于工业化操作， 将其修正为每100 g 补骨脂中加入17 g 黄酒， 169 ℃下加热烘制9 min。 然后， 取3份药材， 每份100 g， 按照上述优化工艺进行验证试验， 测得补骨脂素、 异补骨脂素、 补骨脂甲素、 补骨脂乙素、 补骨脂宁、 补骨脂定、 补骨脂酚、 补骨脂二氢黄酮甲醚含有量分别为0.381%、 0.395%、 0.470%、 0.877%、 0.344%、0.626%、 8.041%、 0.915%， 综合评分86.21， 与预测值86.84 相当， 表明该工艺稳定可行。

图1 各因素响应面图

3 讨论

目前， 补骨脂炮制工艺考察经常仅以补骨脂素、 异补骨脂素含有量作为评价指标［11］， 而本实验选择补骨脂素、异补骨脂素、 补骨脂甲素、 补骨脂乙素、 补骨脂定、 补骨脂宁、 补骨脂酚、 补骨脂二氢黄酮甲醚含有量的综合评分，可避免单一成分的片面性， 为相关生产和临床应用提供参考。 同时， 还采用Box-Behnken 设计［12］优化酒制工艺， 该方法选择实验体系的目标响应值作为单个或多个实验因素的函数， 并在整个区域上找到考察因素和响应值之间的函数表达式， 与正交设计、 均匀设计比较更接近客观实际，而且兼顾了多个影响因素及因素之间的相互作用， 使试验次数较少的同时获得更精确的参数。

补骨脂生品中， 补骨脂素、 异补骨脂素、 补骨脂甲素、补骨脂乙素、 补骨脂宁、 补骨脂定、 补骨脂酚、 补骨脂二氢黄酮甲醚含有量分别为0.403%、 0.410%、 0.499%、0.882%、 0.312%、 0.546%、 8.759%、 0.851%， 而经优化工艺所得酒制品中补骨脂素、 异补骨脂素含有量略微下降，可能是由于酒制过程中的高温使香豆素类成分开环所致；补骨脂酚含有量呈下降趋势， 可能是由于该成分属于单萜酚类化合物， 具有挥发性， 在加热过程中随水蒸气一同蒸发所致， 并且它具有肝毒性和肾毒性［6-7］， 其含有量下降表明酒制可能具有减毒功效； 黄酮类成分含有量呈上升趋势，前期研究表明该现象可能是补骨脂在炮制过程中种皮破碎，从而引起药材溶出率增大［13］， 但本实验在制备供试品时以药材细粉为原料， 避免了因药材组织结构松散而引起含有量变化的干扰， 故其含有量变化可能是药材中各成分之间发生转化， 具体机制还有待进一步研究。

今后， 本实验将考察补骨脂生品及不同炮制品对腺嘌呤致肾阳虚小鼠的治疗作用， 用于明确药材炮制前后的药效学变化， 为其量效关系研究奠定基础。