白念珠菌生物膜耐药机制及中药治疗的研究进展

沈煜宸 曹毅 陶茂灿

(浙江中医药大学第一临床医学院，杭州 310053)

近几年来，由于临床诊治时滥用抗生素、糖皮质激素等药物，导致各种真菌对抗真菌药物的耐药性日渐增强，后续治疗可供选择药物愈来愈少，这类真菌感染性问题的解决迫在眉睫。临床上经常使用的抗真菌药物主要有氟康唑、伏立康唑、酮康唑等。其中氟康唑常被选作治疗真菌感染的药物，但长期使用，不但会导致耐药性大大增加，而且在耐受氟康唑类药物后真菌也会对其他抗真菌药物产生一系列交叉耐药性[1]。因此，目前有许多中药研究是在与氟康唑类药物协同作用的基础上进行抗耐药试验的[2-5]。

1 白念珠菌生物膜耐药机制的研究现状

白念珠菌生物膜是由大量菌丝相细胞、少量酵母相细胞以及由菌体分泌的基质共同组成的复杂结构[6]。白念珠菌生物膜以一种屏障形式导致了真菌耐药。生物膜包被下的白念珠菌与悬浮状态下的白念珠菌相比，前者感染后导致的临床疾病治疗上更棘手，预后情况也更差[7]。因此，研究白念珠菌生物膜的耐药机制对于治疗其引起的感染很有意义。

目前，对白念珠菌生物膜耐药机制的研究主要包括细胞密度、药物外排泵的上调、法尼醇的影响、细胞外基质等因素的影响[8]。

1.1 细胞密度

目前已有研究表明细胞密度是影响白念珠菌生物膜耐药性的一个重要因素，高细胞密度可以使白念珠菌生物膜的最低抑菌浓度(MIC)升高。

Perumal等[9]实验研究了细胞密度对白念珠菌耐药性的影响，在测试了不同的唑类药物后，证明了高细胞密度可明显提高白念珠菌生物膜的最低抑菌浓度。Seneviratne等[10]也通过试验证实高细胞密度能升高白念珠菌生物膜对嘧啶类似物和酮康唑的最低抑菌浓度。

1.2 药物外排泵的上调

白念珠菌生物膜耐药性与多重耐药性转运基因和多重编码的表达有关，药物外排泵的上调已被证实为使白念珠菌生物膜耐药性的升高因素之一[11]。

在多重耐药性转运体的基因中，未成熟白念珠菌生物膜中的MDR1、CDR1和CDR2会在耐氟康唑类药物环境下表达水平更高，而在成熟白念珠菌生物膜内敲除上述单个基因或联合敲除2个或以上基因，高水平的耐药性不会受到任何影响[12]。卜兴胜[13]等测定221名被白念珠菌感染患者的中段尿、痰、粪便、咽拭子中氟康唑最低抑菌浓度(MIC)后发现，耐药组中CDR1和CDR2的基因转录水平明显高于敏感组。研究表明使用氟康唑类药物更易使白念珠菌产生耐药性。

1.3 法尼醇的影响

法尼醇是白念珠菌分泌一种的化学信号分子，可以通过生物膜的构建和生物膜细胞的离散来影响白念珠菌生物膜的形成[14]。最近Yu等[15]发现，法尼醇抑制了麦角甾醇合成途径中的基因表达，从而减弱白念珠菌对氟康唑的耐药性。许雯倩等[16]试验表明白念珠菌生物膜中的麦角甾醇含量与耐药性呈正相关。法尼醇能降低白念珠菌生物膜中麦角甾醇含量，通过破坏细胞膜的稳定性改变其对氟康唑类药的通透性，达到抑制耐药性的作用。

1.4 细胞外基质

与细菌生物膜相类似，白念珠菌的生物膜细胞外基质在维持整个白念珠菌生物膜耐药性以及结构的完整性等方面有着相当显著的作用[17]，β-1,3-葡聚糖是白念珠菌生物膜的主要成分之一，其可以阻止药物渗入，使真菌耐药[18-21]。

1.5 其他机制的研究

药物作用靶酶表达变异，应激状态下的钙调磷酸酶活性上调等都可能与白念珠菌生物膜耐药性有关[22]。多胺可使细胞内活性氧的含量下降，从而导致白念珠菌生物膜形成能力加强而产生耐药性[23]。宿主免疫状态、基础疾病、营养状态、菌株生长速度、基因表达都与白念珠菌耐药密切相关。

2 中药与白念珠菌生物膜的研究

目前中医药治疗白念珠菌的感染的研究已经大量开展，主要通过研究中药中有效成分、中药复方等方面来探讨抗白念珠菌生物膜的问题。

2.1 中药中有效成分的研究

目前有数百种中药已被证实具有抑制真菌的作用，但只有少数中药被研究出具有抗白念珠菌生物膜的作用，有不少研究表明这些少数中药中的有效成分对白念珠菌生物膜作用有抑制作用。穿心莲具有抗病毒、抗肿瘤、抗真菌等作用，而穿心莲内酯是穿心莲主要成分之一[24]。施高翔等[25]发现白念珠菌生物膜内的细胞核在10 mol/L、100 mol/L、1000 mol/L穿心莲内酯浓度下都发生了缩小，并且其线粒体的性质发生改变，细胞内活性氧含量升高。赤芍具有抗肿瘤、降血糖、抗血栓等作用，赤芍苷是赤芍的主要成分之一[26]。王殿明等[27]在体外实验中发现，随着赤芍苷浓度的升高，白念珠菌生物膜中死菌数升高，黏附率下降。在赤芍苷浓度为4 g/L时，其抑制白念珠菌生物膜的形成率超过90%。苦参具有利尿、抗病毒、抗肿瘤等作用，苦参碱是其主要成分。汪长中等[28]观察在不同浓度苦参碱浓度下的白念珠菌生物膜，发现在1.0 mg/mL时白念珠菌生物膜只存在少数酵母细胞，没有菌丝生成；0.1 mg/mL时白念珠菌生物膜可见菌丝及沿着菌丝分布的酵母细胞；0.01 mg/mL时菌丝及酵母细胞大量分布。实验提示苦参碱可以限制白念珠菌生物膜形成。

我科也对中药中有效成分抗白念珠菌生物膜做了研究。ALS1、ALS2、ALS3是白念珠菌细胞壁中大分子糖蛋白ALS基因家族中具有代表性的黏附相关基因。谈潘莉[29]等实验发现黄根醇提取物可抑制ALS2、ALS3基因的转录水平，导致生物膜无法正常形成。

2.2 复方制剂的研究

目前大多数试验研究集中在单味中药或是其单一提取物上，而中草药在临床运用上大多数是复方制剂，复方中多种复合成分作用于人体，故研究复方中药制剂比单味药研究更为重要。麦角甾醇能使白念珠菌生物膜更稳定，维持白念珠菌的致病能力。严园园等[30]研究黄连解毒汤乙酸乙酯提取物联合氟康唑对白念珠菌生物膜中麦角甾醇含量的影响，结果显示单用黄连解毒汤乙酸乙酯提取物或氟康唑的用药组白念珠菌生物膜中麦角甾醇含量下降程度较小，而联合用药组的麦角甾醇含量明显下降；实验发现黄连解毒汤乙酸乙酯提取物联合氟康唑用药能使白念珠菌生物膜受到损伤，从而达到抗生物膜的效应。官妍等[31]研究自制中草药复方制剂(成分：苦参10g，百部30g，野菊花30g，蛇床子50g，土槿皮30g，公丁香10g，黄柏50g，药物浓度调制1 g/mL生药)对白念珠菌体外形成生物膜的影响，实验发现该中药复方对白念珠菌生物膜SMIC50及SMIC80分别为3.255 mg/mL、6.51 mg/mL，证明该中药复方能抑制白念珠菌生物膜形成。刘涛峰等[32]设立对照组比较复合苦参、土槿皮、黄柏、百部、黄连、虎杖、黄芩、大黄、藿香、五倍子中药混合液及以上单味药对抗白念珠菌生物膜的作用，实验得出该复方混合液能明显抑制白念珠菌生物膜形成，且作用效果远远高于单味药。

3 中药影响白念珠菌生物膜的机制

目前抑制白念珠菌生物膜的传统中药，就其作用机制，主要有以下3方面：一是影响白念珠菌细胞黏附能力；二是改变白念珠菌生物膜形态；三是使白念珠菌生物膜细胞凋亡及分散[33]。田玉珠等[34]研究厚朴有效成分和厚朴酚对白念珠菌生物膜的影响，实验发现白念珠菌生物膜在和厚朴酚作用下死菌数增加，生物膜厚度下降；在1000 μg/mL浓度内，和厚朴酚浓度与白念珠菌黏附作用呈负相关。李水秀等[35]探讨汉防己甲素对氟康唑对白念珠菌生物膜的协同作用，实验发现汉防己甲素在体外对氟康唑抗白念珠菌生物膜早期有增效作用，而药物外排泵基因MDR1、CDR1和CDR2可能是使其有增效作用的原因[36]，汉防己甲素在体外能下调药物外排泵基因的mRNA表达，使药物泵出减少，细胞内药物聚积，从而逆转细胞的耐药。

谈潘莉等[37]评价白鲜皮的有效成分白鲜碱对白念珠菌生物膜形成及细胞黏附能力的影响，并且实时荧光定量PT-PCR检测白鲜碱作用后ALS3基因表达情况。实验得出白鲜碱对白念珠菌生物膜SMIC50及SMIC80分别为256 μg/mL和512 μg/mL；白鲜碱作用后ALS3转录水平下降。我科课题组近来开展黄连解毒汤治疗白念珠菌感染的研究。课题组采用新一代高通量测序技术、特异性荧光定量PCR法测定黄连解毒汤处理后白念珠菌转录关键因子[38]，通过转录组测序分析了黄连解毒汤处理前后白念珠菌的基因表达变化，发现黄连解毒汤参与了包括DNA复制、转运蛋白活性在内的26个信号通路，其作用机制可能是通过特定信号途径调控白念珠菌若干基因及其转录因子的转录和表达，从而有利于提升三唑类药物的抗菌效果[39]。综上我们推测黄连解毒汤的抑菌作用是同时作用于白念珠菌的多个信号途径，它的关键基因及作用模式存在多样性，这些实验结果为黄连解毒汤对体外白念珠菌生物膜形成的影响研究提供了新的参考。

4 小 结

随着医学水平的提高、医疗环境的变化，白念珠菌耐药性问题也日益突出，许多研究表明白念珠菌生物膜耐药机制的研究主要包括细胞密度，药物外排泵的上调，法尼醇的影响，细胞外基质等因素。而中药制剂具有来源广、抗耐药性好等特点，目前针对中医药治疗白念珠菌感染的研究已经积极开展。但目前大部分具有抑菌作用的中药是否对白念珠菌生物膜有抑制作用尚不明确，仅有少数中药已研究表明能抗白念珠菌生物膜。同时，目前大多数对白念珠菌生物膜的研究是体外实验，还没有涉及体内环境的研究，白念珠菌生物膜的耐药机制还需要更多研究，而探索更多抗白念珠菌生物膜形成的中药也是研究重点。