肠类器官研究与传统形态学教学相结合的刍议

王锋超，王健欣，杨杰，高美娇，蒋吉英，粟永萍

（1 陆军军医大学军事预防医学系防原医学教研室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆，400038；2 山东潍坊医学院临床医学院人体解剖学教研室，潍坊，261053）

近十年生物医学相关技术领域迎来了跨越式的发展，其中在基因编辑、干细胞及重编程等多个领域较为突出。在干细胞领域除了诱导型干细胞外，类器官（organoid）技术由于其对生命科学和医学等领域的巨大影响，在2013 年被Science 评选为年度十大技术突破；Nature Methods 又将其确定为2017 年的年度技术[1-3]。创新人才培养成为新时期高校的核心任务，特别是培养拔尖创新人才被列入《国家中长期教育改革和发展规划纲要(2010-2020 年)》[4]。作为西南地区的重点医学院校和国家重点实验室的分室，我们承担了陆军军医大学类器官和单细胞技术平台建设，在本科生和研究生带教中，也尝试了将类器官等新技术和传统的形态学相关的教学进行有机的融合。作为医学院校，让医学本科生参与科学研究是培养学生创新思维和科学素养的重要途径，也成为不可以回避的任务[5,6]。我们教研室特别注重科研与教学活动的融合。

1 类器官研究的起源和进展

类器官一词最早应用在肿瘤学领域，例如在1946 年被用于描述皮样囊肿。到20 世纪60 年代以后，类器官培养主要用于描述经典发育生物学实验研究中细胞分类聚集等现象[1-3]。但长久以来，由于技术和实验材料等原因的限制，这些类器官并不能长时间的在体外培养。近年来，随着研究者对干细胞本身特性和微环境认识的不断深入，对生长因子特别是Wnt 通路相关的生长因子的发现和应用以及对新的细胞外基质成分的商品化，终于在2009 年，Sato 等通过模拟干细胞微环境，在基质胶内成功实现了肠道类器官的3D 培养。此后，类器官获得迅速发展，相继在多个系统包括神经、呼吸、消化、内分泌、生殖中实现了成功培养[1-3]。

总体来讲，目前对类器官定义包含以下两个方面：①类器官的细胞来源，可以是全能性的胚胎干细胞和诱导的全能性干细胞，也可以是成体组织的干细胞或者前体细胞。②类器官的特性，在体外能够自动组装成类似于在体器官的包含多种分化功能细胞的微观结构，并至少能够重现在体器官的部分功能。目前，类器官从细胞成分来说：主要是指上皮来源的细胞进行自我组装，其中也可以包含间质细胞等其他细胞成分，大部分类器官可以长期的传代培养[2,3]。

2 和传统细胞培养相比类器官的优势

和传统的2D 细胞培养相比，3D 类器官培养具有独特的优势。首先是空间和形态学的优势。2D 细胞不能反映组织细胞的空间排布，在信号通路激活等多个方面和在体组织和器官相去甚远。只有具有3D 结构的类器官培养才能谈得上对在体组织器官在形态和组织结构上进行模拟。另外2D 细胞培养的繁殖过程只是平面上细胞数量增加并逐渐产生接触抑制，而类器官的生成过程伴随着干细胞的增殖和分化，不同分化状态的细胞间相互诱导、反馈、影响，形成了特有的细胞间通信模式，可做到同类型细胞的聚集，能再现体内器官发生的多个方面[2,3]。比如肠道类器官，具有增殖能力的细胞聚集在一个区，可形成类似于在体的“隐窝样”结构；在隐窝结构中与在体肠壁类似，Lgr5 干细胞和Paneth 细胞比邻；而相对分化的吸收细胞聚集在一个区域，形成“绒毛样”结构，保持了和在体的高度一致性。

其次，两种培养在细胞干性维持和基因组稳定性上存在巨大差异。在1965 年细胞学家海弗列克（Hayflick）发现正常人胚胎来源的成纤维细胞在衰老之前只能扩增40-60 代左右。目前，成体干细胞例如间充质干细胞在体外2D 培养体系中只能在较短的时间和代数内维持细胞干性。而长期维持的2D细胞株培养系统大都是永生化修饰的细胞或者是具有永生化能力的肿瘤细胞。另外，这些细胞在长期培养过程中均面临着基因组不稳定性的巨大挑战。而类器官却具有稳定的表型和遗传学特征，例如肠道来源类器官在体外持续传代1 年以上都能维持自己的干性，并且发生极少的碱基突变[1,2]。所以，目前类器官是体外模拟上皮组织的最佳方式。

3 胚胎/诱导型干细胞来源的类器官研究可以和组织发育相关的教学相结合

传统的器官发育相关教学主要依赖于不同时期胚胎组织的切片和大体标本及其影像资料[7]，旨在为学生描述器官发育的一个基本过程。以胃肠道发育为例：原肠胚受信号调控不断完善内胚层，使其进一步发育成包含前肠、中肠和后肠的原始肠管。前肠可以形成口腔、食管、胃、肝脏等，中肠可以形成小肠和升结肠等，后肠可以形成余下的结肠和直肠等部分。但是，凭借这些手段，不能动态的、精细的显示器官的发育过程，更难理解干细胞是如何向一个特定的组织和器官发育调控的。目前，因为难以获得人类胚胎材料，研究人员直接分析人类的器官发生和发育几乎是不可能的，另外，受伦理问题的制约，人类胚胎体外培养也限定在14 天以内[2,8]。

最新的进展显示类器官生成却可以忠实地再现体内发生的许多发育步骤。科学家第一次实现由干细胞诱导分化成有功能的类器官是由辛辛那提儿童医院的James M. Wells 实验室完成[9]。他们对原始的多能性胚胎干细胞，通过使用activin A 激活干细胞内TGF-β 信号通路, 促使其向内胚层分化；接着在培养体系中添加FGF4 和Wnt3a, 使其特异性地向后肠分化, 形成后肠球状细胞体；然后将这种细胞体转移到Sato 等创立的成体肠干细胞培养体系，即包埋入基质胶,同时添加肠道干细胞增殖必需的子R-spondin1 (Wnt 信号激活)、EGF、Noggin (BMP 通路抑制剂), Wnts 等生长因子，最终可以成功诱导形成包含各种肠上皮细胞和一些基质成纤维细胞的成熟肠类器官[9]。

我们在本科生第二课堂和研究生科学进展研讨时候介绍了相关工作。通过提问、回顾和讨论等方式，我们引导学员进行下列问题的研讨：科学家如何利用书本上经典的发育学知识来指导最前沿的干细胞研究？干细胞来源的类器官培养又在哪些方面模拟和显示了肠道的发生过程？这些过程与完整的胚胎发育有何相关性？全能干细胞的诱导分化和成体干细胞来源的类器官培养有什么异同？此外，根据类似的机理和策略，不同组织特异性类器官包括胃、肾、肺、肝等相继被建立和报导[2,8]，为这个教学议题提供了丰富的素材。我们通过让部分本科生和研究生进行延伸性文献阅读，对不同器官和系统间进行对比，分析其中的区别和联系，使他们更好的了解了特定器官的发育过程，同时建立了用类器官去模拟在体的思维方式和相关的知识储备。

4 类器官研究和干细胞相关疾病模型教学相结合

4.1 利用肠道干细胞帮助学生理解干细胞和组织更新的概念

医学生通过细胞生物学和组织胚胎学的学习，对胚胎干细胞、诱导全能性干细胞和成体干细胞的概念有了初步的认识。因为成体的发育均来源于一个单细胞即受精卵，学生对胚胎干细胞的全能性比较容易理解。相比较而言，对单个成体干细胞的自我更新和多种分化潜能，学员还缺乏直观的认识。相对于皮肤、神经、血液等系统，单个肠道干细胞的培养和分析比较容易进行。本实验室在前期工作基础上[10]，已经建立了相关的技术平台，在教员前期准备和指导下，可以让学生自己观察单个的Lgr5肠干细胞在基质凝胶内的增殖和分化，即在一周的时间内从一个细胞成长为一个球囊合并出芽的类器官结构。这个结构包含了多种细胞类型，并可以长期传代。在教学活动中，我们会首先和学员讨论类器官在形态上和组织切片中观察到的肠道器官结构上的异同，确认包含增殖细胞的隠窝区域和包含分化、死亡细胞的绒毛区域。然后让同学讲述他们是如何理解肠干细胞特性的，而单细胞水平相对于多细胞研究有什么样的优势。这些和科研活动密切结合的、参与式的教学活动不但让学员更加直观的理解了成体干细胞的概念，也极大地提高了学生的兴趣和积极性。学生们都惊讶于一个成体干细胞像胚胎干细胞一样也有自己的“发育蓝图”，在没有其他细胞的信息指引下，能自我复制和不断分化，形成具有一定功能的包含多种细胞的类器官结构。

4.2 通过类器官模型让学员理解干细胞和微环境之间的关系

在介绍类器官的相关概念和系统时，我们还着重让学员理解干细胞和微环境之间的关系。比如组织和胚胎学教学中会强调消化道粘膜的基本构成即上皮、固有层和基层。结合肠道类器官模型，引导学生思考和讨论的问题主要包括：固有层成分是否对干细胞起作用？基质凝胶能够代替固有层的什么功能，又不能代替什么功能？上皮细胞为什么不依赖固有层的细胞就能够完成自我塑型？固有层里面的免疫细胞是否能支持和影响肠道干细胞？通过对这些问题的讨论，加深了学员对原有组织学知识的理解。另外，学有余力的学生还通过查询最新的文献，了解了免疫细胞例如巨噬细胞和先天淋巴细胞对肠干细胞的调控作用，积极参加了学校组织的本科生文献阅读和讲解大赛，得到了进一步的锻炼，也让他们能近距离的接触科学发展的最前沿。

4.3 通过类器官模型让学员理解组织的损伤修复过程

类器官的研究已经广泛用于包括遗传性疾病、感染等多种疾病的模型[1-3,,8]。本教研室以放射复合伤和急性放射病研究为主，肠道类器官为我们研究急性放射病肠道损伤和筛选相关的抗放射病药物提供了良好的实验模型。在传统的教学手段中，我们只能依赖放射损伤前后不同时间实验动物取材的肠道病理切片展示肠道组织的一些形态学变化，不能再现肠道隠窝细胞的损伤和再生的动态过程；另外学生对于较高剂量照射导致的隠窝克隆的消失缺乏直观的感受。通过类器官培养平台，我们制作了不同剂量X 射线照射的模型，学生通过倒置显微镜清晰的观察到隠窝结构在受到照射后的缩短、恢复和再延长的整个连续过程。针对射线造成的“克隆形成细胞”死亡，传统的教学中依赖于一些永生化的细胞株或者肿瘤细胞株在2D水平的克隆形成实验，即在辐射前后以不同密度在培养皿接种细胞，在一定时间后计数存活克隆的数目；这些实验不仅耗费的时间长，也难以在形态学上模拟肠道隠窝的消失和存活。我们通过对培养24h-48h 后隐窝进行不同剂量的X 射线照射，绘制了良好的剂量存活曲线，并创建了相关的染色和成像方法，对存活和死亡肠类器官克隆进行直观的区分和统计[11]。这些手段使学生在组织形态学层面更好的理解了肠上皮细胞损伤和再生，也在细胞生物学层面更清晰的认识到了“克隆形成细胞”的存活对组织再生的重要性。

5 小结和展望

为了实现拔尖创新医学人才的培养，增强医学生的科研意识和创新能力，需要在教学和培养各个环节进行优化[4,6,12]。最新的生物医学科研进展不断被吸纳到“形态学”相关的教材中，例如“细胞重编程”、“诱导型干细胞”的概念和内容已经加入人民卫生出版社的第五版《医学细胞生物学》和高等教育出版社的《组织学与胚胎学》第二版中。可以预见，随着干细胞技术、生物材料技术等技术的蓬勃发展，类器官在医学和生命科学中的应用必将大放异彩，这就对本科生和研究生的相关教材和教学内容提出了新的需求。值得注意的是，相对于上世纪出现的2D 细胞培养技术，类器官技术让我们第一次能将“模拟”的思维带入形态学相关的教学中，促使学生从新的角度去理解在发育、疾病相关的组织形态改变中对干细胞的调控，思考干细胞相关的再生和修复等基本的生命科学问题，更好的训练学生建立“模型和模拟”的思维，增强科研意识，培养创新习惯，也形成了一个科研和教学相互融合和促进的生长点。