水稻维生素B6与SSR标记的关联分析

孙茂霖，孙 健，石 尚，刘化龙，郑洪亮， 赵宏伟，谢冬微，王敬国，邹德堂

(1.东北农业大学 农学院，哈尔滨 150030; 2. 黑龙江省农业科学院 经济作物研究所，哈尔滨 150086)

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。近年来，随着市场对高品质稻米需求量的提升，在保证产量的前提下提高水稻的营养品质已成为水稻育种的热点[1]。维生素作为人体必须的重要营养元素，是衡量水稻营养品质的重要指标[2]。维生素B6(Vitamine B6, VB6)又称吡哆素，是一种水溶性维生素，包括吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)及它们的磷酸衍生物。VB6参与了细胞内的多种代谢，在生物体内发挥着极其重要的作用[3]。有研究表明，摄取足量的VB6能有效减少心血管疾病、高血压、癫痫、糖尿病、肾脏疾病、神经系统疾病，糙皮病等疾病的发病率[3]。VB6的辅酶形式(PLP)可通过增强免疫系统和延缓肿瘤发展而对癌症有积极的影响[4]。还有研究表明，神经疾病如抑郁症、阿尔茨海默病、自闭症，精神分裂症、癫痫和帕金森病等均与VB6缺乏有关[5]。

植物和微生物是自然界中VB6的制造者，而动物只能从食物中获取VB6。水稻作为人们的主食之一，也是重要的VB6来源[6]。如果其VB6增加，人体日常VB6的吸收量就会增加，有利于身体健康。但大多数水稻品种的VB6极低，因此，选育出富含VB6的品种对于保证人体健康具有重要意义。目前，国内外已有对影响VB6合成关键酶基因的报导，如Ehrenshaft等[7]在研究尾孢菌对自身毒素的抗性中发现了涉及VB6代谢的基因SOR1，后来鉴定为PDX1。随后，该研究小组又从尾孢菌鉴定出涉及VB6合成的第2个基因PDX2[8]。Tambasco-studart等[9]在拟南芥中发现了参与VB6从头合成途径的4个基因，其中，有3个为PDX1的同源基因(AtPDX1.1,AtPDX1.2,AtPDX1.3)，还有1个为PDX2的同源基因(AtPDX2)。刘海峰[10]在水稻中同样发现了PDX1的同源基因(OsPDX1.1,OsPDX1.2, OsPDX1.3)。

关联分析(GWAS)是以连锁不平衡为基础，鉴定某一自然群体内目标性状与分子标记或候选基因间关系的一种分析方法[11]，在水稻和其他作物中已被广泛应用[12-14]。本研究以314份不同地理来源的水稻品种为材料，对其进行连续2 a的VB6测定，利用154对SSR标记与VB6进行关联分析，旨在挖掘与VB6相关的SSR标记位点，为水稻高VB6的分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

314份水稻品种来源于黑龙江省104个、吉林省46个、辽宁省30个、日本92个、韩国19个、朝鲜11个、俄罗斯7个、法国3个、美国2个。分别于2016、2017年种植于东北农业大学实验实习基地，4月中旬播种，5月中旬移栽，试验地设计为行长3 m，双行区，行距30 cm，穴距10 cm，3次重复，水肥病虫害管理同一般大田管理。

1.2 VB6质量分数测定

水稻成熟收获后，种子经过3个月的自然风干，使其生理生化性状稳定。用糙米机将种子研磨成糙米，将糙米研磨成粉，过60目筛，采用苏州科铭生物技术有限公司生产的VB6测定试剂盒测定样品的VB6质量分数。其原理为VB6与4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在390 nm有特定吸收峰。记录在390 nm的波长下的吸光值，代入标准曲线，计算得到样本总VB6质量分数。对每个样品测定3次，取平均值。

1.3 SSR标记分析

采用简化的CTAB法[15]进行DNA提取。选取于水稻12条染色体上均匀分布的1 000对SSR标记，由上海生工生物工程有限公司合成。筛选出具有多态性的154对SSR引物对314份品种进行PCR扩增。

扩增体系包括3 μL的模板DNA(25 ng/μL)，2μL SSR引物(12 ng/μL)，2 μL PCR缓冲液，1.5 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.3 μLTaq酶(5 U/μL)，0.2 μL dNTP(10 mmol/L)，最后加入11 μL ddH2O使总体积达到20 μL。

PCR程序为94 ℃预变性6 min；38个循环(94 ℃下变性30 s，47 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s)；72 ℃下延伸5 min，4 ℃下保存。PCR扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳及银染法检测。

1.4 数据分析

采用Excel 2007软件对VB6质量分数表型数据进行基本统计分析。

用STRUCTURE 2.3.4软件进行群体结构分析[12]，估计最佳群体K，其取值范围为2～8，参数iterations设为100 000，burn-in period设为1 000 000，每个K值重复运行5次。依据似然值最大的原则选取合适的K值作为群体数目，若对数似然值lnP(D) 随亚群数K值的增大而增大，则采用ΔK来确定合适的K值[16-17]。

利用TASSEL 3.0软件计算154个SSR标记位点两两之间的D′值，用于评价供试群体的LD程度(等位基因频率<5%的稀有等位基因作为缺失处理)。以P≤0.01时，判定位点之间的LD达到显著[18]。将STRUCTURE 2.3.4软件运行后形成的Q值作为协变量，运用TASSEL 3.0软件中的GLM和MLM模型，分别进行性状与标记的关联分析[19]。

将2 a在2种模型中均定位到的位点进行整理，以群体平均值为对照进行优异等位变异的挖掘，并计算优异等位变异的表型效应值[20]，同时筛选出具有该等位变异的优质品种。

2 结果与分析

2.1 VB6的变异分析

对2016与2017年测定的314个水稻品种的VB6变异进行统计分析(表1)，可以看出2016年品种的VB6的平均值为68.52 μg/g，变幅为39.70～127.24 μg/g，变异系数为14.78%。2017年品种的VB6的平均值为69.18 μg/g，变幅为42.95～138.48 μg/g，变异系数为15.32%。从2 a的VB6数据可知，不同品种间VB6变异范围大，具有丰富多样性。表2列出材料中VB6最高和最低的品种各10种，并按由高到低进行编号，发现最高的10个品种的VB6均高于80 μg/g，而最低的10个品种普遍低于50 μg/g，其中，‘龙锦1号’2 a平均VB6最高达到132.86 μg/g，‘花叶稻’在所有品种中2 a平均VB6最低仅有42.56 μg/g。在VB6最低的10个品种中，‘空育131’在黑龙江省被广泛种植，但它的VB6仅有49.67 μg/g，有极高的改良价值。

2.2 群体结构分析

利用314个水稻品种的154个SSR标记基因型数据，通过STRUCTURE 2.3.4软件进行群体结构分析。发现lnP(D)随K持续上升，因此不能通过似然值最大的原则选取K值，需采用ΔK来确定合适的K值( 图1)，发现K为3时ΔK最大，因此有3个亚群。图2中314份供试材料被划为由红色、绿色和蓝色代表的群体。每条竖线代表1份材料，竖线上的彩色片段代表材料所属群体的比例。将比例超过65%的同种颜色的材料归于同一亚群，其余材料归于混合亚群。将亚群命名为第一亚群、第二亚群、第三亚群和混合亚群，发现第一亚群包含黑龙江品种53份，吉林品种17份，日本品种18份，俄罗斯品种2份，朝鲜品种1份；第二亚群包含黑龙江品种12份，吉林品种4份，俄罗斯品种5份，日本品种1份；法国品种1份；第三亚群包含辽宁品种29份，吉林品种16份，黑龙江品种9份，日本品种64份，朝鲜品种7份，韩国品种7份，美国品种2份；混合亚群包括黑龙江品种30份，吉林品种9份，辽宁品种1份，韩国品种12份，日本品种9份，朝鲜品种3份，法国品种2份。通过STRUCTURE 2.3.4软件计算K为3时的Q值并用于关联分析。

表1 314份水稻品种的VB6变异Table 1 Variation of VB6 in 314 rice varieties

表2 VB6极高和极低的部分水稻品种Table 2 Rice varieties with the highest and lowest VB6

2.3 连锁不平衡分析

不同位点间的连锁不平衡是关联分析的基础[21]。如图3所示，以D′ 与P值绘制矩阵图，用于观测SSR位点之间LD的排列。通过154个SSR标记分析，在11 782个SSR位点成对组合中，不论是同一连锁群还是不同连锁群，都存在一定程度的LD。D′统计概率(P<0.01)支持的LD成对位点1 566个，占全部位点组合的13.3%，D′平均值为0.38，整体LD水平较高。

图1 STRUCTURE软件分析预测的lnP(D)和ΔKFig.1 Estimated lnP(D) and ΔK over ten repeats of structure analysis

图2 群体结构(K=3)Fig.2 Population structure (K=3)

2.4 关联分析

利用TASSEL3.0软件中的GLM和MLM模型，对数据进行性状与标记的关联分析，当P≤0.01认为位点与性状显著关联。由表3可知，2 a共检测到与VB6相关的位点13个，其中2017年通过GLM模型定位到的RM254贡献率最高为11.69%，所有位点的贡献率范围为3.87%～11.69%。2 a在至少一种模型中检测到的位点有6个，分别是位于第11号染色体上的RM254，位于12号染色体的RM309，位于4号染色体的RM518，位于6号染色体的RM540，位于8号染色体的RM1271以及位于10号染色体的RM24856；其中，RM254、RM309和RM540在 2 a 2种模型中均被检测到。

2.5 优异等位基因及载体材料

对2 a中在GLM和MLM模型中同时检测到的3个显著关联的位点进行进一步的优异等位基因挖掘。因为标记间等位变异的表型效应值为正数时才对水稻的VB6有促进作用所以将2 a中表型效应大于零的优异等位变异进行整理，并同时列出携带该等位变异的3个最佳品种(表4)。由表4可知，2 a中优异等位基因共8个，其中，RM254-200、RM254-205、RM309-185、RM540-205、RM540-215、RM540-230在2 a中均被发现，RM540-230 表型效应值最高分别达到了6.23和5.91。2 a中发现较优载体材料‘辽星6’‘越实’‘花脸’等有较高VB6且至少含有2个以上优异等位变异。

图3 供试材料154个SSR位点间连锁不平衡的分布Fig.3 The LD distribution of 154 loci in the detected accessions

年份 Year方法 Method标记 Maker染色体 ChromosomeP值 P value贡献率/% R22016GLMRM20826.16E-033.99RM254111.61E-0611.37RM309122.28E-045.84RM51587.68E-034.64RM51841.26E-048.15RM54063.12E-058.65RM54788.82E-035.89RM58311.20E-037.46RM127154.55E-035.75RM131321.18E-036.41RM24856105.79E-036.51MLMRM254119.08E-047.52RM309123.92E-034.04RM51846.92E-035.29RM54066.07E-035.05RM131323.63E-035.922017GLMRM15281.94E-034.68RM254119.29E-0711.69RM309123.21E-045.62RM51844.55E-047.24RM54066.35E-058.11RM127159.74E-035.12RM136964.47E-037.06RM24856101.29E-037.68MLMRM254111.44E-048.92RM309124.98E-033.87 RM54064.82E-035.21

表4 与VB6相关的优异等位变异及载体材料Table 4 Excellent alleles associated with VB6 in the materials

3 讨论与结论

VB6作为一种日常必需的维生素，在人体中发挥着重要的作用。但在水稻中对VB6的研究较少，并未有关联分析方面的报导。因此，通过关联分析挖掘与VB6相关的SSR标记，对后续研究有重要意义。本研究采用的314个水稻品种组成的群体材料来自于不同国家和地区，它们地理来源广泛，同时对品种的VB6变异进行统计分析，发现不同品种间VB6变异范围大，具有丰富多样性，是进行关联分析良好材料。对VB6最高和最低的品种进行整理，发现‘龙锦1号’‘辽星6’‘花脸’等10个品种VB6最高，达到80 μg/g以上。‘花叶稻’‘公苗糯’‘空育131’等10个品种VB6最低，普遍低于50 μg/g。在VB6最低的10个品种中，‘空育131’在黑龙江省被广泛种植，可通过与VB6较高的品种‘龙锦1号’和‘辽星6’等杂交，进行改良。

群体遗传结构分析是关联分析的前提[22-23]。本研究通过对群体结构分析减少了群体分类对关联分析的影响，避免人为因素对亚群划分的影响。通过STRUCTURE 软件对供试材料进行群体结构分析并划分为3个亚群，并将所得Q值作为协变量纳入计算，降低了亚群混合造成的伪关联概率，使关联分析结果更具准确性。此外，研究通过2 a的2种模型(GLM模型和MLM模型)对SSR标记与VB6进行关联分析。其中，MLM模型不仅考虑了群体结构Q值，同时还考虑了亲缘关系K值，使检测到的标记数目少于GLM模型中的标记数。同时对2 a的2种模型的结果进行分析，得到的结论更有全面性更可靠。

通过2 a的2种模型对与VB6相关的位点进行挖掘，共检测到与VB6相关的位点13个，贡献率范围为3.87%～11.69%，其中RM254、RM309和RM540在2 a的2种模型中均被检测到，RM254贡献率最高为11.69%。在研究发现的位点中，RM24856与水稻中的PDX1基因的同源基因OsPDX1.2位置相近，该基因已被证实能影响水稻VB6，超量表达该基因能提高水稻VB6水平[10]。RM24856位点位于第10染色体上的95 524 bp～95 543 bp，OsPDX1.2位于第10染色体上的80 964～82 250，两者距离仅13 274 bp，RM24856位点极有可能与OsPDX1.2连锁。

进一步对RM254、RM309和RM540位点的优异等位变异进行挖掘，发现优异等位基因共8个，其中RM254-200、RM254-205、RM309-185、RM540-205、RM540-215、RM540-230在2 a中均被发现，RM540-230 表型效应值在2 a最高中最高，分别达到6.23和5.91。挖掘出有较高VB6且聚合了与VB6相关的优异等位变异的载体材料‘辽星6’‘越实’‘花脸’等，可作为亲本用于日后的分子辅助育种。