一种耐铀植物促生菌的筛选及促生特性研究

王焯 罗学刚 丁翰林 杨昊

（西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 621010）

目前世界上对放射性污染治理采取的主要方法包括物理、化学和生物修复。生物修复以其成本低廉、不产生二次污染而受到许多学者的关注。生物修复主要包括动物修复、植物修复和微生物修复。其中植物修复技术对环境干扰小、操作简便、绿色、原位且易于为公众接受等优点，成为当前环境科学和污染生态学等领域的研究热点［1-3］。但单纯通过植物修复技术来促进对放射性核素的吸附富集，虽然从理论上分析可以有效治理铀污染。但是在放射性污染环境中植物生长缓慢，效果不明显且周期长。目前多数对放射性核素具有超富集的植物基本都存在生物量较低，生长缓慢，适应非原产地土壤环境较差等问题［4］，所以增加植物的生物量、提高植物对新环境的抗性或者适应性成为植物修复放射性污染土壤技术中的关键。

植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）在重金属污染的条件下，通过分泌铁载体、有机酸、表面活性剂、固氮酶、1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate de-aminase，ACC）、植物生长激素：3-吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）等物质，可以改善植物生长发育境况，促进植物成长，增强重金属胁迫条件下的植物生物量，提高植物修复的效率［5］。陈可等［6］利用荧光假单胞菌、绿针假单胞菌橙色亚种能明显促进博落回抗干旱能力和对铀的富集量。何琳燕等［7］从镉超积累植物龙葵体内和根际土壤中分离筛选到能够产生IAA的细菌，能够明显增加油菜幼苗根的长度。李艳梅等［8］从花生根际得到5株耐镍产铁载体芽孢杆菌，其中 HSGJ1能有效促进花生生长，增加生物量。Dell’ Amico等［9］从重金属污染的禾本科牧草中得到的根际促生菌，大部分都表现出 ACC 脱氨酶活性，且都能增加植物生长。但目前利用放射性污染地区的植物内生菌促进植物对铀的富集研究还相对较少。因此，本文拟以某典型铀尾矿采集的蓼科植物酸模为材料，通过铀耐受实验以及定性定量分析各菌株的植物促生性能，以期分离出对铀具有耐受性的植物促生菌，并该菌株接种到苜蓿根部，提高苜蓿的铀积累量和生物量，为铀尾矿污染土壤的植物修复提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物样品 供试的酸模植株于2017年10月采自某铀尾矿区和附近地区，将取样植株和根系附近土壤整体装入样品袋，带回实验室进行进一步处理。1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基（LB培养基）：牛肉膏10. 0 g，蛋白胨10. 0 g，氯化钠 5. 0 g，蒸馏水1 000 mL，调整pH值至7.0±0.2，于120℃灭菌15 min。铀筛选培养基：在LB培养基加入5 g/L的乙酸双氧铀，使培养基中铀浓度为100 mg/L。King’s培养基：10 mL丙三醇，蛋白胨 20.0 g，磷酸氢二钾1.5 g，硫酸镁1.5 g，蒸馏水1 000 mL，调整pH值至7.2±0.2，于121℃灭菌15 min。Dworkin and Foster 培养基（DF 培养基）：磷酸氢二钠 6.0 g，磷酸二氢钾 4.0 g，硫酸镁 0.2 g，葡萄糖 2.0 g，葡萄糖酸 2.0 g，柠檬酸 2.0 g，三氧化钼 10.0 mg，硼酸10.0 mg，硫酸锰 11.2 mg，硫酸铜 78.2 mg，硫酸锌124.6 mg，硫酸亚铁100.0 mg，蒸馏水1 000 mL，调整pH值至7.0±0.2，于120℃灭菌15 min。ACC筛选培养基：将DF培养基中的硫酸铵替换成ACC。

表1 试验土壤的理化性质

1.2 方法

1.2.1 酸模根部耐铀内生菌的分离筛选 将从铀矿区采集的的酸模样品用自来水清洗干净后，用去离子水漂洗3次。取样品健康完整的根部，置于75%的酒精中消毒5 min，在于0.2%的次氯酸钠溶液中消毒10 min，完成后用去离子水冲洗5遍，同时取最后一遍的去离子水100 μL，涂布于 LB 固体培养基，以检测样品表面消毒是否彻底。将完成消毒的根系样品放入无菌研钵中，加入适量已消毒的石英砂，加入5 mL经过过滤除菌的PBS缓冲液，进行研磨。取不同稀释倍数的研磨液100 μL涂布于铀筛选固体培养基中，在30℃下，培养3 d。

1.2.2 内生促生菌筛选 采用Salkowski比色法测定菌株产IAA能力［10］。采用李振东［11］的方法制作比色液和标准曲线。将待测菌株接种到含有100 mg/L色氨酸的LB培养基中，以不含色氨酸的培养基为对照，在30℃，150 r/min的条件下培养24 h。取6 mL发酵液在10 000 r/min条件下，离心10 min。取上清液1 mL加入试管中，同时加入1 mL比色液，15 min观察颜色变化。将溶液变红色菌株保留，在取剩下的5 mL上清液，加入5 mL比色液，黑暗下静止30 min，立即用紫外分光光度计测定OD530值。代入标准曲线，计算IAA含量。每组实验重复3次。

上述产IAA菌株的ACC脱氨能力。参照张国壮［12］的方法，将待测菌株接种到LB培养基中，25℃，150 r/min下，培养24 h。取1 mL培养液，接种到DF培养基中，25℃，150 r/min下，培养24 h。取前一步的培养液1 mL，接种到ADF培养液中，25℃，150 r/min下，培养24 h。取最后一步的培养液100 μL接种到ADF固体培养基中，25℃培养3 d，观察生长情况。将长势良好的菌株保留，再次接种到含8 mL含3 mmol/L的ADF液体培养基中，25℃，150 r/min下，培养24 h。将培养液在4℃、8 000 r/min下，离心10 min，收集菌体，加入5 mL 0.1 mol/L pH 7.6的Tris-HCl缓冲液，悬浮菌体。在4℃、8 000 r/min下，离心10 min，收集菌体，重复该步骤3次以除去培养基。向第三次离心得到的菌体中加入1 mL 0.1 mol/L pH=7.6的Tris-HCl缓冲液，混悬后，然后转移至2 mL离心管中，16 000 r/min下离心5 min。之后将菌体沉淀再次悬浮于0.6 mL 0.1 mol/L pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，加入30 μL甲苯，漩涡振荡30 s以破碎菌体。吸取0.2 mL破碎细胞菌悬液，加入20 μL 0.5 mol/L ACC溶液，混匀后于30℃条件下水浴15 min。然后向其中加入1 mL 0.56 mol/L HCl混匀，室温下16 000 r/min离心5 min。取上述离心上清液1 mL，加入0.8 mL 0.56 mol/L HCl，混匀后再加入0.3 mL 2 g/L的2，4一二硝基苯肼，30℃下水浴30 min。然后，加入2 mL 2 mol/L NaOH显色，测定540 nm下测定其吸光值OD540，以蒸馏水代替菌悬液的处理作为对照。将样品的OD540。代入标准曲线得到其中α-丁酮酸的含量，计算每分钟ACC脱氨酶催化ACC生成α-丁酮酸的物质的量，即单位酶活力U。利用考马斯亮蓝法以牛血清蛋白为对照，测定剩余的菌株悬浮液中蛋白质含量（μg）。用单位酶活力除以总蛋白质量即为比活力（U/μg），以此表示细菌的ACC脱氨酶活性。

1.2.3 内生菌重金属抗性实验 分别挑选1.2.1实验中的外观形态有差异的单菌落接种于LB液体培养基中扩繁24 h，吸取100 μL扩繁培养液接种到含有不同浓度的重金属LB液体培养基中，在30℃，150 r/min条件下培养5 d。同时通过测定培养基OD600值确定菌落生长情况，以此得到每株菌株的耐受最低重金属浓度即最小抑制浓度（MIC）。其中，铀质量浓度为100、150、200、250、300、350 mg/L，铅质量浓度为200、400、600、800、1 000、1 200 mg/L，锰质量浓度为400、600、800、1 000、1 200、1 400 mg/L，镍质量浓度为25、50、75、100、125、150 mg/L。

1.2.4 内生菌的生理生化及分子鉴定 依据《常见细菌系统鉴定手册》，对所筛得的菌株D16进行初步生理生化试验［13］。目的菌株在 LB 固体培养基上生长，肉眼观察菌落在培养基上的培养特征。对菌体用革兰氏染色后，在光学显微镜下观察其形态。

菌株的DNA 提取参照杨圣［14］的方法。以总DNA 为模板，采用通用引物pA（50-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和pC5B（50-TACCTTGTTACGACTT）PCR扩增菌株的16S rDNA序列提取DNA。测序由成都戴维赛特生物科技有限公司完成。测序后在NCBI 数据库用 Blast 软件进行序列比对，随后用MEGA 7. 0软件、邻位连接法构建系统发育进化树，并进行 1 000 次的相似度重复计算。

1.2.5 内生菌促生特性研究 研究上述筛选的菌株在不同条件下的IAA产量和ACC酶活性。将菌种接种到设置的不同条件的液体培养基中，在150 r/min下，培养24 h，分别测定IAA含量和ACC脱氨酶活性。其中，研究pH、温度、转速产IAA培养基选用LB培养基，条件设置为：pH为4、5、6、7、8；温度为20、25、30、35、40℃；转速为 90、120、150、180、210 r/min。研究氮源、碳源产IAA培养基选用King’s培养基，条件设置为：碳源为甘油，葡萄糖，蔗糖，木糖，麦芽糖；氮源为硫酸铵，硝酸钾，尿素，蛋白胨，酵母粉。转速为90、120、150、180、210 r/min。ACC脱氨酶选用ADF培养基，条件设置为pH为4、5、6、7、8；温度为20、25、30、35、40℃ ；ACC 底物浓度为 0.5、5、50、500 μL。

1.2.1 检查前护理工作 护理人员需要为患者提供良好的护理环境，并且要确保检查设备的完善程度，具体需要将患者检查环境温度控制在20～24℃，将湿度控制在50%～60%，并且要定期对检查科室进行清洁和消毒工作，以此来预防院内感染现象。此外，护理人员需要结合患者的病情和心理承受能力，对患者进行适当的安慰和开导，并向患者讲述基本的检查流程，提高患者对胃镜检查工作的了解程度。

1.2.6 苜蓿促生菌盆栽实验 盆栽实验，每盆装土1 kg。设置铀浓度分别为 25、50、75、100 mg/kg。苜蓿种子经表面灭菌，催芽后种植入含铀土壤中，每盆种植10颗。接菌处理，将所筛菌株接种到King’s培养基中，以所得的最佳条件培养24 h。将所得培养液4℃，8 000 r/min离心，弃去上清液，用无菌水冲洗3次，调整OD600值为1，每盆均匀喷洒50 mL，每15天添加1次。以不加菌液为对照，喷洒等量的无菌水。每个处理设置3个重复。60 d后收获植物，将植物120℃杀青0.5 h，80℃烘至横重。1.2.7 数据处理 参考苏峰丙［15］的方法测定植株的铀含量以及植株铀积累量，植株铀积累量=植株铀含量×植株干重。利用 DPS 7.5 进行数据分析；Origin Pro 8. 5 软件作图。

2 结果

2.1 耐铀内生菌的分离筛选

经过分离纯化，从铀尾矿区酸模根部分离出细菌32株，其中有11株在100 mg/L的铀筛选平板上长势良好。分别为D1、D4、D5、D6、D11、D13、D15、D16、D18、D26、D29。

2.2 待测菌株促生潜力研究

如图1所示，D5、D16和D26具有产IAA能力和ACC脱氨酶活性，D5菌株24 h产IAA含量为58.6 mg/L，ACC 脱氨酶活性为 0.14（U/μg）。D16 菌株24 h产IAA含量为40.21 mg/L，ACC脱氨酶活性为 0.32（U/μg）。D26菌株 24 h产 IAA 含量为 18.3 mg/L，ACC脱氨酶活性为0.34（U/μg）。由于这3种菌株的IAA产量和ACC脱氨酶活性都相对较高，因此选用D5、D16、D26进行下一步实验。

2.3 内生促生菌铀及伴生重金属抗性实验

如表2所示，D5菌株对铀、锰、铅、镍4种重金属的最小抑制浓度为300、1 200、1 000、75 mg/kg；D16菌株对铀、锰、铅、镍4种重金属的最小抑制浓度为350、1 200、800、125 mg/kg；D26菌株对铀、锰、铅、镍4种重金属的最小抑制浓度为300、1 400、1 200、100 mg/kg。D16对铀、镍有较强的耐受能力。D26对锰和铅具有较强的耐受能力。

2.4 D16的生理生化及分子鉴定

图1 耐铀菌株的植物促生特性

表2 待测菌株的最小重金属抑制浓度

因为D16菌株具有较强的铀耐受性（表2），且具有较好的植物促生性能（图1）。因此，将其选为目标菌株。依据细菌分类手册对其进行了生理生化鉴定实验（表3），革兰氏检测结果为阴性。对D16的基因组 DNA 进行 PCR反应得到1 649 bp 大小的扩增片段，扩增后的 DNA片段经过纯化测序，并在 Gen Bank 中与相似性较高的菌株进行比对，发现D16与木糖氧化无色杆菌相似度最高，相似度为99%。进一步构建系统发育树（图2），证实该菌株与木糖氧化无色杆菌亲缘关系最近。

2.5 D16促生特性研究

2.5.1 温度对D16菌株的生长和产IAA的影响 由图3-A所示，在20-35℃范围内，D16菌株的生长量随温度升高而增加，在35℃时达到最大值，OD600值为2.54。35℃后，生长量开始降低，到40℃时OD600值为1.93。IAA的产量随生长量的改变而改变，因此，在20-35℃时，IAA产量逐步增加，在35℃时，达到最大值，最大IAA产量为42.12 mg/L。35℃后，IAA产量开始降低，到40℃时，IAA产量为23.72 mg/L。

2.5.2 不同转速基对D16菌株的生长和产IAA的影响 如图3-B所示，转速在90-180 r/min时，D16菌株的生长量随转速提高而逐渐增加，OD600分别为2.69、2.72、2.75、2.78，当转速高于180 r/min后，菌株生长量开始下降，当转速为210 r/min时OD600为2.55，由此可知，转速对D16的生长量影响较小。但在90-150 r/min范围内，IAA产量随转速增加而快速增加，分别为28.94、31.55、38.98 mg/L，且在150 r/min，达到最大值。当转速大于150 r/min时，IAA产量先下降后上升，在180、210 r/min时分别为 37.16、40.91 mg/L。

表3 D16菌株的生理生化鉴定

图2 基于16s rDNA序列构建的系统发育进化树

2.5.3 pH对D16菌株的生长和产IAA的影响 如图3-C所示，pH 为 4 和 8 时，D16菌株生长受到抑制，IAA产量下降。pH8时，菌株受到的抑制作用最大OD600值为2.02，IAA产量最少为17.82 mg/L。pH在 5-7时，菌株生长量逐渐增加，且在pH6时达到最大值OD600为2.46。在pH为4-6这段范围内IAA 分泌量缓慢增加。当pH在6-7时，IAA 的增长速率随着 pH 的增大迅速变大并于pH7时达到最大，最大产量为34.84 mg/L。

2.5.4 氮源对D16菌株的生长和产IAA的影响 从4-A可以看出，5种氮源对D16菌株生长影响的顺序为：酵母膏＞蛋白胨＞尿素＞硫酸铵＞硝酸钾，当氮源为酵母膏时，菌体生长量最大，OD600为2.41；对菌株分泌 IAA 的影响顺序为：酵母膏＞蛋白胨＞尿素＞硫酸铵＞硝酸钾，当氮源为酵母膏时，菌株产IAA的活性最强，IAA产量为37.82 mg/L。

2.5.5 碳源对D16菌株的生长和产IAA的影响 由图4-B所示，5种碳源对D16菌株生长影响的顺序为：甘油＞蔗糖＞葡萄糖＞蔗糖＞木糖＞麦芽糖，当碳源为甘油时，菌体生长量最大，OD600为0.97。对菌株分泌IAA的影响顺序为：甘油＞蔗糖＞葡萄糖＞木糖＞麦芽糖。当甘油为碳源时，菌株产IAA的活性最强，IAA产量为10.76 mg/L。

2.5.6 底物浓度对D16菌株产ACC脱氨酶的影响 如图5所示，菌株D16的脱氨酶活性随着底物浓度的增加而上升。在底物浓度为0时，脱氨酶活性几乎检测不到。

2.5.7 pH对D16菌株产ACC脱氨酶的影响 如图6-A所示，当培养基pH小于5时，D16菌株无法诱导产生ACC脱氨酶；当pH大于7时，酶活开始受到抑制；pH7时，酶活最大为0.312 6 U/μg。

图3 不同培养条件对D16菌株的生长和IAA产量的影响

2.5.8 温度对D16菌株产ACC脱氨酶的影响 如图6-B，当温度在20-30℃时，D16菌株ACC脱氨酶活性随温度升高而升高。在30℃时，酶活达到最大值为0.317 9 U/μg。当温度高于30℃，酶活显著下降，在40℃时，检测不到酶活。

图4 不同氮源、碳源对D16菌株的生长和IAA产量的影响

图5 底物浓度对D16菌株产ACC脱氨酶的影响

2.5.9 转速对D16菌株产ACC脱氨酶的影响 如图6-C，转速对D16脱氨酶的活性影响不大。当转速在90-180 r/min时，D16菌株的ACC脱氨酶活性随转速提高而缓慢增加，分别为0.311 0、0.325 1、0.325 2、0.343 8 U/μg，当转速高于180 r/min后，酶活开始缓慢下降，当转速为210 r/min时，酶活为0.3148 U/μg。2.5.10 D16菌株对苜蓿生长与铀积累的影响研究 由图7可知，在接种D16菌株后，能提高苜蓿的生物量。其中，在没有铀胁迫的情况下，能提高干重160%；在25 mg/kg的铀胁迫下，能提高67.5%的干重；在50 mg/kg的铀胁迫下，能提高29.5%的干重；在75 mg/kg的铀胁迫下，能提高17.9%的干重；在100 mg/kg的铀胁迫下，能提高110.4%的干重。

图6 不同培养条件对D16菌株的ACC脱氢酶的影响

由图8可知，接种菌株D16后，苜蓿中铀的含量和积累量也有所提高。在25 mg/kg的铀胁迫下，能提高12.2%的铀植株含量，铀的积累量却没有提高；在50 mg/kg的铀胁迫下，能提高45.5%的铀植株含量和11.8%的铀植株积累量；在75 mg/kg的铀胁迫下，能提高36.3%的铀植株含量和88.8%的铀植株积累量；在100 mg/kg的铀胁迫下，能提高180.6%的铀植株含量和78.6%的铀植株积累量。

3 讨论

图7 不同铀浓度处理下D16对苜蓿生物量的影响

图8 不同铀浓度处理下D16对苜蓿富集铀的影响

在植物修复放射性和重金属污染中，植物促生菌的加入是一个较佳的方法，它能促进植物生长同时减轻放射性核素及重金属对植物的胁迫作用［16］。Ying等［17］从铜矿区土壤筛选的一株氧化木糖无色杆菌对铜的最小抑制浓度能达到600 mg/L，重金属污染地区的植物内生菌通常表现出较高的重金属耐受能力［18］。本研究从某典型铀尾矿区的蓼科植物酸模根部分离筛选出耐受一定浓度铀的菌株D16，对铀的最小抑制浓度能达到350 mg/kg，经鉴定为氧化木糖无色杆菌种。这说明该种菌株具有较强的重金属耐受力。

植物促生菌所分泌的IAA是一种重要的植物激素，参与整个植物的生长发育过程，能促进植物生长，增加植物根系对矿质元素的吸收［19］。潘风山［20］从镉超积累植物东南景天根部分离出一株产IAA的细菌，可使油菜地上部分的生物量提高 18.6%，同时对镉的积累量提高45%。在重金属、干旱等逆境条件下，乙烯会在植物体内过量产生，抑制植物根系的生长，阻碍植物体正常的生长发育［21］。植物促生菌产生的1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶能将ACC 分解成 α-丁酮酸（α-ketobutyrate）和氨，这种物质是合成乙烯的前体物质。从而降低植物体内乙烯的水平，同时氨能作为植物所需氮源被利用，从而缓重金属给植物生长发育带来的不良压力，提高植物对重金属离子的吸收［22］。吉云秀［23］从被石油污染的盐渍地区的植物翅碱蓬的根际土中分离出4种含有ACC脱氨酶的植物促生菌，且均能提高燕麦或者黑麦草的耐盐性和生长参数。现有的研究表明，如果菌株具有一种促生性能，便具有促进植物生长的潜力［24］。本研究所筛菌株D16所表现的植物促生特征包括产生IAA和具有ACC脱氨酶，可能有更好的促生效果。

在诱导IAA培养基中，当pH为7时，菌株D16的IAA产量最大，这与徐文思［25］等筛选的菌株的产IAA的最适 pH 为8的结果不同，其原因应该是由于筛选出的菌株种属不同。D16菌株随转速增加生长量缓慢增加，而IAA产量迅速增加，可能是由于菌株的生长和IAA产生均是好氧过程，菌株优先保证生长繁殖，再产生次生代谢产物。当以酵母膏和蛋白胨为氮源时，菌株D16的生长量和IAA的产量都为最高，说明有机氮源对菌株D16优于无机氮源。

当培养基中无ACC时，菌株检测不到ACC脱氨酶活性，而随着ACC浓度升高，酶活性增强，这与蒙渊［26］的结果相一致，这说明ACC脱氨酶为诱导酶。菌株D16所产ACC脱氨酶活性在pH为7时，有较高酶活，而当pH小于7时酶活迅速下降，pH大于7时酶活降低缓慢，这与沈萍［27］的结果相似，说明ACC脱氨酶不耐酸，而对偏碱性条件有一定的适应力。

将植物内生菌用于提高植物修复土壤重金属效率已有较多研究，从商陆中筛选出的一种芽孢杆菌SLS18，不仅能促进甜高粱生长，还能提高对 Mn /Cd的吸收［28］。Zhang等［29］研究发现一株鞘氨醇单胞菌不仅可以增加东南景天生长，同时能提升东南景天对 Cd 的吸收。促生菌促进植物修复铀污染的研究相对较少，Muhammad［30］的研究表明，利用从牧豆树枝分离的3种促生菌可以促进双稃草的生长和对铀和镉的积累。紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生的豆科草本植物，具有很强的环境适应力。Peralta-Videa等［31］的研究表明，紫花苜蓿对土壤中的Cd、Cu 或 Zn 具有较强的富集能力，是一种很有开发和利用价值的土壤修复植物。唐永金［32］和金星等［33］研究表明，紫花苜蓿能够很好的吸收和富集土壤中的铀。本研究从铀尾矿区植物酸模根部分离出一株耐铀内生菌，结果表明该菌株可以促进苜蓿生长，同时还能提高苜蓿对铀的积累能力，这对于植物修复铀尾矿区的污染土壤具有十分重要的作用和意义。

4 结论

从某典型铀尾矿区植物酸模根部分离到的一株耐铀菌株具有较强的IAA产率和ACC脱氨酶活性，经过生理生化及分子鉴定表明该菌株属于无色木糖氧化杆菌。该菌株最佳产IAA条件为35℃，pH为7，转速为150 r/min，氮源为酵母膏，碳源为甘油；最佳ACC酶活条件为温度为30℃，pH为7，转速180 r/min。该菌株植物促生特性能使苜蓿干重分别提高17.9%-110.4%；植株对铀的富集率分别提高12.2%-180.6%。