棉花GhDMT3的功能验证及生物信息学分析

杨笑敏 王俊娟 王德龙 陆许可 陈修贵 郭丽雪 王帅 陈超王晓歌 韩明格 叶武威

（中国农业科学院棉花研究所 棉花生物学国家重点实验室 农业部棉花遗传改良重点开放实验室，安阳 455000）

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）在DNA甲基转移酶的催化下把甲基（-CH3）转移到DNA分子中特定碱基上的过程称为DNA甲基化的过程［1］。多数发生在CpG岛的胞嘧啶第5位碳原子（C5）上，通常发生在对称序列CG中，但是在CHG和CHH（H=A、C或T）序列中也有发生［2］。DNA甲基化是一种广泛存在的表观遗传过程，包括转座子的抑制、基因组印记［3］、X染色体失活［4］、细胞分化［5］和胚胎发育［6］。在胁迫条件下植物通过DNA甲基化过程，诱导一些与抗逆相关的基因表达，增强植物的抗逆性，维持植物的生长发育和进化过程［7］。DNA甲基化是一种植物响应逆境胁迫的分子机制［8］。植物中存在2种DNA甲基化方式：一种是维持甲基化（Maintenance methylation），通过半保留复制把双链DNA分子的一条链存在甲基化，另一条链没被甲基化的亲代甲基化模式传递给子代［9］；另一种是从头甲基化（De novomethylation），通过不同的DNA甲基转移酶催化将不存在甲基化的DNA双链形成甲基化［10］。植物中的C5-DNA甲基转移酶有4种，维持DNA甲基转移酶（Methyltransferase，MET）家族［11］；染色质甲基化酶（Chromomethylase，CMT）家族［12］；Dnmt2；结构域重排甲基转移酶（Domains rearranged methyltransferase，DRM）家族可以在RNA指导下，催化胞嘧啶从头甲基化，以及维持非CpG位点的甲基化［13］；MET、CMT与动物的DNMT1 为同源［14］；DRM 与动物的 DNMT3 同源［15］。

非生物胁迫严重影响和制约着农作物的产量和品质。当烟草发生渗透胁迫时（NicotianaL.）组织培养细胞的异染色质区会发生DNA超甲基化［16］。CHROMOMETHYLASE3（SLCMT3）基因可以使Chr番茄果实的成熟，提高控制成熟关键基因的表达［17］；当萝卜（Raphanus sativusL.）受到重金属铬胁迫时DNA的甲基化水平会升高［18］；玉米（Zea maysL.）受到冷胁迫时，根系通过降低核小体中心DNA甲基化水平诱导ZmMI1表达，受到盐胁迫时玉米幼苗zmPP2C甲基化将下调和zmGST表达量也下调［19］；大豆受干旱、冷、盐胁迫时，根中CaDRM1和CaDRM2的表达量上调，以应对胁迫压力［20］；苜蓿种子发育和结瘤的早期阶段MtDRM1和MtDRM2高度表达，MtDRM3在种子和结节发育阶段表达量高［20］。DNA甲基转移酶与抗逆性密切相关，深入对DNA甲基转移酶的作用机制进行研究，对进一步挖掘抗逆基因具有重要意义。

棉花作为重要的经济作物，其棉纤维可以制作成织物，棉籽可以榨油，在人们的日常生活中应用广泛。胁迫条件下，棉花产量会大幅度减产；DNA甲基转移酶可以增强植物的耐受性，GhDMT3是DRM家族的一员，在水稻中鉴定出2个DRM家族相关基因、苜蓿中鉴定出4个DRM家族的成员、在大豆中发现5个DRM家族相关基因、在玉米和拟南芥中各含有2个DRM家族的成员，而棉花中的DNA甲基转移酶研究较少。本研究通过对棉花GhDMT3进行生物信息学分析，并构建pYL156：GhDMT3沉默载体，对其进行功能验证，为提高棉花抗逆性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

陆地棉TM-1由中国农业科学院棉花研究所品种资源研究室保存。所用菌种为大肠杆菌E.coliDH5α，农杆菌 LB3101、pYL156、pYL192（辅助载体）和pYL156：GhDMT3（阳性对照载体）载体由中国农业科学院棉花研究所基因组测序课题组提供。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的制备 按照北京艾德莱生物科技的RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒说明书提取RNA，按照北京全式金的TransScript ΙΙ All-in -One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal） 说明书制备cDNA。

1.2.2GhDMT3的克隆 用Primer Premier 5软件设计GhDMT3引物（F：ATGGTTGACAATAATTCGGGTGG；R：TCAGATAATCATTGATTTTGTG），以cDNA为模板进行扩增，PCR程序为94℃ 5 min；94℃20 s，54℃ 20 s，72℃ 70s，34 个循环；72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收、纯化，与T载连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞，筛选阳性单克隆并测序，获得正确的t-GhDMT3序列。

1.2.3 构建pYL156：GhDMT3的VIGS载体 用EcoRⅠ和XmaⅠ双酶切PYL156，获得线性pYL156载体，以克隆载体t-GhDMT3为模板用引物in-VGhDMT3进行扩增，获得VIGS片段。用in-FuSion技术将GhDMT3的VIGS沉默片段插入到线性的PYL156载体上，转入大肠杆菌，挑取阳性单克隆测序，获得正确的单克隆，并用EcoRⅠ和XmaⅠ双酶切验证，成功构建pYL156：GhDMT3载体。

1.2.4 pYL156：GhDMT3的VIGS沉默及表达量检测 种植TM-1到两片子叶平展时，用一次性的医用注射器在叶片的背面，进行VIGS注射，注射面积在75%以上。然后置于25℃黑暗培养24 h，处理结束后，在适宜的温度（28℃ 14 h/25℃ 10 h）下保证幼苗正常生长。当出现白化后，对植株分别进行冷（4℃）和干旱（自然干旱）处理，当与对照出现表型差异时，测定GhDMT3的相对表达量。

2 结果

2.1 GhDMT3蛋白的理化性质及亲水性/疏水性分析

通过ExPASY网站的生物软件ProtParam程序对GhDMT3编码的蛋白进行组分分析，该蛋白质相对分子质量为71 107.02 kD，等电点为4.85，该基因编码的蛋白质分子式为C3151H4897N849O981S23，共计9 901个原子，编码640个氨基酸，其中65个带正电的氨基酸（Arg +Lys），96个带负电的氨基酸（Asp+Glu），不稳定系数为36.33，脂肪系数为81.81，总平均亲水性为-0.364，预测该蛋白为酸性蛋白，不含有赖氨酸和丝氨酸，色氨酸含量最低为1.6%，亮氨酸含量最高为10.2%。

2.2 GhDMT3蛋白质的亲疏水性分析

图1 GhDMT3蛋白的疏水性/亲水性检测

利用ProtScale网站对GhDMT3蛋白的亲疏水性进行预测，结果（图1）表明，在256位的S亲水性最强分值为-2.357，在517位的F疏水性最强分值为1.210，亲水性总平均值为-1.157，推测该基因的整个氨基酸序列中亲水性氨基酸比疏水性氨基酸多，所以该蛋白为亲水性蛋白。综上所述，该基因编码的蛋白具有一定的亲水能力但不稳定。

2.3 GhDMT3蛋白的跨膜分析

通过TMHMM网站对GhDMT3蛋白的跨膜结构域进行分析（图2），GhDMT3蛋白不存在跨膜结构域，属于非跨膜蛋白，与该蛋白的疏水性区域分析结果基本一致。利用SignalP-4.0网站对GhDMT3蛋白的信号肽预测结果为C值（剪切位点）为0.114，S值（信号肽）为0.109，Y值（综合剪切点）为0.105（图3）。GhDMT3蛋白并不是分泌型蛋白，不在细胞中发生迁移。

图2 GhDMT3蛋白的跨膜结构域分析

图3 GhDMT3蛋白的信号肽预测

2.4 GhDMT3蛋白的二级结构分析

图4 GhDMT3基因编码蛋白的二级结构

通过软件预测分析GhDMT3蛋白的二级结构。结果（图4）表明，无规则卷曲包含298个氨基酸残基，占46.56%，α螺旋包含266个氨基酸残基，占41.11%，延伸链包含67个氨基酸残基，占10.47%，β-转角包含33个氨基酸，占5.12%。

2.5 GhDMT3蛋白的三级结构分析

使用软件SWISS-MODEL预测GhDMT3蛋白的三维结构，GhDMT3蛋白三维结构以α螺旋为主（图5），符合GhDMT3蛋白的二级结构分析。

图5 GhDMT3蛋白的三级结构

2.6 构建GhDMT3的VIGS载体

利用RT-PCR技术扩增GhDMT3，转T载体，获得t-GhDMT3；以克隆载体t-GhDMT3为模板，对in-v-GhDMT3进行扩增，获得VIGS片段（图6-A）。用in-FuSion技术将GhDMT3的VIGS沉默片段插入到pYL156载体上，并用EcoRⅠ和XmaⅠ双酶切验证（图6-B），即成功构建pYL156：GhDMT3载体。

2.7 VIGS侵染后棉花的表型和GhDMT3的表达量分析

图6 VIGS载体pYL156：GhDMT3的构建与验证

VIGS侵染棉花植株15 d左右，阳性植株叶片白化明显，其他正常生长，用没有侵染的棉花和用pYL156侵染的棉花作对照，对沉默植株进行冷、干旱的胁迫处理。冷处理36 h后植株表型差异明显（图7-A），注射pYL156的植株与野生型的新生真叶枯萎卷曲，注射pYL156：GhDMT3的植株正常生长，表型变化不明显。pYL156侵染的棉花中在不同胁迫下表达量无显著变化，与对照相比，用pYL156：GhDMT3侵染过的棉花GhDMT3转录水平明显下降。根部下降最多；茎部次之；叶片下降最少（图7-B）。

自然干旱6 d后植株表型差异明显，注射pYL156的植株和野生型的子叶脱落，新生真叶发黄枯萎，严重失水，植株死亡，注射pYL156：GhDMT3的植株真叶没有枯萎失水现象（图8-A）。检测pYL156：GhDMT3侵染过的棉花中GhDMT3的相对表达量，由图可知pYL156侵染的棉花中在不同胁迫下表达量没有变化，用pYL156：GhDMT3侵染过的棉花中GhDMT3转录水平与对照相比叶片中下降最多；茎部次之；根部下降最少（图8-B）。

图7 VIGS侵染后的棉花表型和冷胁迫36 h的棉花表型（A）；VIGS侵染成功冷胁迫处理后植株的相对表达量（B）

图8 VIGS侵染后的表型和干旱胁迫6 d的表型（A）及VIGS侵染成功干旱胁迫处理后植株的相对表达量（B）

3 讨论

DNA甲基转移酶是DNA甲基化过程中的关键酶，在拟南芥［10］、水稻［21］、玉米［22］、大豆［20］、葡萄［23］、番茄［24］及蓖麻［25］等植物中鉴定出 DNA 甲基转移酶。GhDMT3与蓖麻中的DRM家族基因编码蛋白一致，该家族基因编码蛋白为不稳定的亲水性蛋白，不具有跨膜结构域，二级结构以无规则卷曲、α螺旋为主为。通过分析GhDMT3三维结构与DNA甲基转移酶的典型结构类似，但是有一定的区别，具体原因需要后续实验探明。

大豆的DRM基因在非生物胁迫期间转录水平较高参与诱导DNA甲基化改变［20］，当拟南芥drm1和drm2双突变时会造成所有已知模式的胞嘧啶从头甲基化均有缺失［10］，DRM家族基因对于FWA和SUP的基因沉默是重要的，可以通过不同的机制使直接重复和反向重复发生甲基化［26］。通过沉默GhDMT3基因，证明该基因与抗逆性相关，为明确该基因的功能奠定基础，而该基因的具体功能需要进一步研究。

4 结论

成功构建了GhDMT3的VIGS沉默载体，获得转基因植株，在冷、干旱胁迫条件下，转基因植株抵抗力增强。